本文由客座博客Dominik Paquet和Dylan Kwart贡献路德维希-马克西米利安大学Marc Tessier-Lavigne在纽约洛克菲勒大学的实验室。
的CRISPR / Cas9系统是一个通用的工具，在许多生物体和模型系统中进行精确的基因编辑。我们已经广泛使用CRISPR/Cas9在人类中进行序列特异性改变诱导多能干细胞．CRISPR/Cas9复合物在许多细胞类型的基因组DNA中引入双链断裂(DSBs)非常有效，经常导致双等位基因修饰。最常见的是，dsb是由nonhomologous end-joining (NHEJ)途径，导致非特异性核苷酸插入、缺失或其他突变，称为“indels”。虽然这很容易产生基因敲除，但NHEJ修复不允许引入特定的序列变化。
为了产生特定的序列变化，细胞必须经历homology-directed修复(HDR)，一种独特的细胞DNA修复途径。完成这一过程通常需要同时引入一个同源DNA修复模板，如单链寡脱氧核苷酸(ssODN)，其中包含要纳入编辑基因组的预期序列变化。在哺乳动物细胞中，如干细胞，HDR相对少见，dsb主要由NHEJ修复。虽然其他研究小组专注于提高总体HDR率的策略，但我们最近的研究表明，通过(1)通过防止重新编辑提高编辑准确性，以及(2)优化“剪切-突变距离”，可以更有效地生成HDR所需的基因组编辑事件。此外(3)，我们已经开发了一个框架，通过结合这两种策略，允许您具体地合并homo-或杂合突变。
1.通过CRISPR/ cas阻断突变提高HDR准确性
2013年，在人类细胞中使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑后(丛等，梅等)我们非常高兴能在实验室建立一个基于crispr的编辑平台。我们的目标是利用该系统在iPSCs中引入致病突变(或将它们纠正回野生型)，将它们分化为受疾病影响的体细胞，并研究这些细胞的问题。然而，当我们对我们的细胞进行测序时，我们的兴奋变成了沮丧，发现我们的编辑是多么低效。尽管我们能够在与痴呆症相关的基因中引入所需的突变，如APP和PSEN1，但在大多数情况下，预期的HDR事件被同一等位基因上不需要的插入物破坏，可能是由于伴随的NHEJ修复。在PSEN1位点上，超过90%的HDR编辑等位基因出现了不必要的插入/删除，因此这些等位基因对我们的研究无效。如果我们现在还考虑到HDR是罕见的，通常只有2-5%的编辑细胞在我们手中，这些综合的缺陷使得在筛选合理数量的单细胞克隆时，几乎不可能找到0.2-0.5%的正确编辑等位基因。此外，CRISPR/Cas9编辑通常是双等位基因的，这意味着即使一个等位基因被精确编辑，另一个可能包含不需要的插入子。
这一观察,我们测试了一种策略,讨论了在该领域,但从来没有系统地分析:介绍沉默CRISPR / Cas9阻断突变PAM(一个G的一个变化,T或C -但避免NAG)或指导RNA序列目标(“种子”)。他们的想法是，一旦引入所需的编辑，这些“阻断突变”突变将阻止CRISPR重新切割目标序列。
我们发现，阻断突变使每个等位基因编辑的准确性提高了10倍。如果一个细胞中的两个等位基因都被编辑，其编辑精度将提高100倍(Paquet, Kwart等人2016年）.对于那些参与挑选iPSC克隆的繁琐工作的人来说，挑选100个克隆和挑选10000个克隆的差别是100倍的减少!因此，我们强烈鼓励任何研究人员在基因编辑时在两个目标等位基因上加入CRISPR/ cas阻断突变。
 |
| 图1:提高编辑效率的技术。 |
但是什么更好:阻断pam还是引导RNA阻断突变?这完全取决于你编辑的位点，以及阻断突变是否需要沉默。在我们看来，改变PAM位点总是最好的，但是我们也证明了引导RNA阻断突变的效率。因此，如果该位点不允许阻断PAM序列(例如，如果它会导致错义或无义突变)，阻断引导RNA结合位点就会很有效。然而，由于一些引导rna可能会容忍结合序列的不匹配，我们建议尽可能改变几个接近PAM的碱基(见下文找出原因)。请查看我们最近的研究以了解更多细节(Paquet, Kwart等人2016年)Kwart, Paquet等人2017年）.
如果你的基因座根本不允许你使用永久阻断突变，比如当你编辑一个非编码DNA区域时，该怎么办?为此，我们开发了一种名为CORRECT的技术，通过经过两轮基因编辑，可以在无疤的情况下引入预期的突变，同时利用阻断突变提供的更高效率。从本质上讲,你:
步骤1-引入阻断突变和预期序列的改变，并筛选几百个克隆，以找到正确的一个
步骤2-使用修复模板第二次编辑细胞，纠正阻塞突变，再次从几百个克隆中识别正确的克隆。
从这两个步骤中，你将总共筛选几百个克隆体——总比10000个强吧?(Kwart, Paquet等，2017年)。
在Addgene的CRISPR指南页面找到更多的CRISPR资源
2.优化“cut-to-mutation距离”
尽管我们已经控制了过度活跃的Cas9，并重复了阻断突变的实验，但我们仍然对我们的编辑结果不完全满意，在许多情况下仍然没有得到我们想要的。在我们通过深度测序研究的大多数HDR读取中，Indels都消失了，但有趣的是(令我们沮丧的是)，在许多情况下，我们只看到了阻断突变的合并。尽管阻断突变和我们的预期突变在同一个oligo上，但预期突变很少进入。细胞似乎只使用了修复模板的一部分，而在HDR过程中，远离剪切位点的突变并没有被有效地整合。
我们决定系统地描述这一现象，并发现了从CRISPR/Cas9剪切位点突变的距离与它被合并的频率之间的一般关系。我们惊讶地发现，随着离切点距离的增加，突变融合的效率迅速下降。如果距离仅为10 bp，效率已经下降了一半，在仅30 bp后，不筛选数千个克隆以找到阳性的突变不再可行。所以如果你有比克隆采摘更好的事情要做，明智地选择你的引导rna(让他们剪短)。
 |
| 图2:剪切位点与突变距离和编辑效率的关系。 |
3.优化同源或杂合突变的“切割-突变距离”
当我们进一步思考上述距离关系时，我们意识到，除了提高突变掺入效率外，我们还可以利用这种关系来指导细胞的合子性。这对我们来说很重要，因为我们研究的阿尔茨海默病突变在患者中是杂合的。随着突变距离的增加，突变合并的概率会降低，突变可能只会插入其中一个等位基因，而不会插入另一个等位基因——编辑的效率太低了，一个细胞不可能有两个成功的突变。
我们通过将数据显示的单等位基因突变合并概率乘以计算获得homo和杂合子突变的可能性，发现为了产生效率最佳的纯合子HDR事件，应该使用靶向期望突变的切距<10 bp的引导RNA。对于杂合子事件，理想情况下，切点应远离切点5 - 20 bp。最后,如果需要一个杂合的事件只是指导rna这一目标非常接近目标突变网站是可用的,修复模板包含阻塞和目的突变可以与另一个同样混合ssODN模板,包含相同的CRISPR / Cas-blocking突变而不是突变。在这里，只阻断模板将与阻断/预期突变模板竞争，导致细胞在每个目标位点上使用其中一个或另一个。
 |
| 图3:杂合子和纯合子突变的最佳切割位点到突变距离。 |
综上所述，为了通过HDR有效而特异地引入所需的序列变化，最佳引导rna不仅要有足够的对靶活性和极低的脱靶活性，还应该根据所需的合子度，在与预期突变位点的最佳距离介导DSB。此外，应该将CRISPR/ cas阻断突变纳入HDR修复模板，从而最小化引导RNA的重新编辑活性。
非常感谢我们的客座博主Dominik Paquet和Dylan Kwart
多米尼克·帕奎特(Dominik Paquet)目前是路德维希-马克西米利安大学中风和痴呆研究所的神经生物学教授慕尼黑．他的实验室开发了基于ips的神经退行性和神经血管疾病模型。他在纽约洛克菲勒大学Marc Tessier-Lavigne的实验室做博士后时，就参与了上述项目。
Dylan Kwart是洛克菲勒大学Marc Tessier-Lavigne实验室的一名研究生。他目前致力于通过开发新的基于ipsc的模型系统来理解阿尔茨海默病的病理机制。
参考文献
1.Cong, Le等。“使用CRISPR/Cas系统的多重基因组工程。”科学339.6121(2013): 819 - 823。PubMedPMID: 23287718．公共医学中心PMCID: PMC3795411．
2.Mali, Prashant等。“通过Cas9进行rna引导的人类基因组工程。”科学339.6121(2013): 823 - 826。PubMedPMID: 23287722．公共医学中心PMCID: PMC3712628．
3.Paquet, Dominik等。“利用CRISPR/Cas9高效引入特定的纯合和杂合突变。”自然533.7601(2016): 125 - 125。PubMedPMID: 27120160．
4.Kwart, Dylan等人。“使用CORRECT对干细胞进行精确、高效、无疤痕的基因组编辑。”自然的协议12.2(2017): 329 - 354。PubMedPMID:28102837．
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
留下你的评论