AAV滴度:它们来自哪里，有什么意义?

还记得游戏节目“25000美元金字塔”吗?在这个节目中，一个玩家试图让另一个玩家通过列出属于这个类别的东西来猜出这个类别。好吧,让我们玩。我会列举一些例子，你们试着猜一下类别:

ELISA……
qPCR……
数字滴PCR……
DNA点污点……
转导化验……
sds - page……
电子显微镜……

猜测吗?

这是正确的…效价的方法AAV！

关键是有很多方法可以量化a的组成病毒载体通常这些方法测量溶液的不同特性。这些特征为我们提供了三个重要因素的信息。

AAV滴度能告诉你什么?

1. 物理效价:含有病毒基因组的病毒粒子的浓度。物理滴度是通过量化病毒基因组的浓度来测量的qPCR或其他DNA定量方法(见下文)，因为每个病毒颗粒通常包含一个病毒基因组。除了理论上的最大值，物理滴度并不一定表明感染滴度。病毒载体的感染滴度可根据转导靶点而变化，也可通过病毒溶液的冻融而改变(Lock等人，2010年）.

2. 传染性效价:可转导细胞的病毒颗粒浓度。传染性滴度通常通过细胞转导测定来定量。据报道，野生型AAV2具有近乎完美的物理和感染粒子比为1:1 (泽特纳等人，2010年）.然而，对于重组AAV2，同样的研究报告了物理与感染粒子的比例为50:1 (泽特纳等人，2010年）.病毒制剂的特异性传染性是由物理病毒颗粒与感染性病毒颗粒的比值来定义的。
   
   
3. 病毒衣壳充盈与空壳的比率:包含基因组的病毒粒子与病毒衣壳总数(包括没有病毒基因组的空衣壳)的比率。根据产生AAV的实验条件，病毒生产过程中可以形成空病毒衣壳。一项研究表明，大约50%的病毒衣壳包含基因组(“完整”)(泽特纳等人，2010年)，而另一篇报道称，重组AAV2颗粒中只有20%是满的，而野生型AAV2库存中有50%是满的(格林等人，1999年）.包含基因组的病毒衣壳的百分比通常是通过病毒载体溶液的电子显微镜来量化的。由于这项技术是密集的，需要电子显微镜，它不是常规地对所有新的病毒载体制备。Addgene通常使用这种方法来验证我们的病毒载体制备方案，我们很高兴地报告，在代表性的病毒载体制备中，超过95%的病毒衣壳包含基因组(图1)。
   
   *感谢哈佛大学纳米系统中心的David Bell和Svetla Stoilova-McPhie。

图1:阴性染色后Addgene AAV病毒载体的电镜图。阴性染色后可以识别出空的载体颗粒，其颜色比完整的载体颗粒要深。这张图片显示了绝大多数的矢量是由完整的粒子(白色箭头)相对于空粒子(黑色箭头)组成的。比例尺= 100nm。

人们通常报告什么滴度?

Addgene和其他病毒载体制造设备报告病毒溶液的物理滴度(图2)。由于物理滴度用于临床前研究的剂量目的，了解这些值的含义以及如何进行比较是很重要的。

图2:Addgene AAV aliquots的标签。我们的滴度值(红色圈出来的)报告了物理滴度，这是通过qPCR测量的。

物理效价通常由两种流行的基于pcr的方法计算:

• 定量PCR (qPCR)
• 数字液滴PCR (ddPCR)

历史上，定量DNA杂交法(DNA点印迹法)曾被用于AAV的滴定，但该方法目前尚未广泛应用(Fagone等人，2012）.

基于pcr的方法健壮、简单、快速、方便。然而，由于PCR会受到许多实验因素的影响，这些方法对AAV的定量并不一定是精确或准确的。以下列出量化AAV的一些复杂因素:

• AAV基因组和itr之间的重复和自互补导致AAV基因组的二阶结构会影响qPCR的效率。
• qPCR的效率受温度参数的影响。例如，我们发现改变PCR的退火温度从60°C - 61°C提高分析的可靠性。
• 不同的引物具有不同的退火效率(Wang et al.， 2013）.虽然你可以为每个样品优化你的引物，这将减少方便性和可比性，因为每个样品都是用不同的引物对进行定量。
• Ct值根据PCR起始物质的数量而变化，因为样品必须落在标准曲线的线性区域内。此外，高浓度和低浓度样品在PCR中也可能表现不同，即使这两个样品都在检测的线性区域内。这可能是由于引物和AAV基因组重复序列之间的结合位点竞争。
• 引物退火会受到蛋白质污染物的影响，这是AAV滴定中的一个因素，因为起始模板是纯化的病毒载体溶液(包含病毒衣壳蛋白)，而不是纯化的DNA。使用纯化的病毒DNA作为模板而不是完整的AAV颗粒，可能会减轻这种情况。
• 最后，该测定法的精度可为最终滴度值的两倍，这仅仅是由于测定法的噪声。换句话说，重复两次完全相同的PCR可以得到两倍的滴度测量。

如何获得更可靠的AAV滴度?

为我们的病毒服务目前，我们通过qPCR滴定AAV载体的制备。为了确保准确可靠的结果，我们在以下几个方面优化了我们的分析方法:

• qPCR的绝对定量要求生成已知浓度的标准曲线。我们定期制定和验证新的质粒标准。
• 我们通过使用通用AAV参考标准材料(AAV SFM)来验证我们的绝对定量，这是一个AAV样本，已经被世界各地的16个实验室定量，可以被研究人员用于验证他们的qPCR分析(Lock等人，2010年）.除了AAV RSM外，我们还包括了第二个已知滴度的AAV参考样品，其滴度高于AAV RSM。通过在我们所有的qPCR检测中使用这些样本，我们确保了生成的标准曲线是可靠的，从而可以用来准确地推断新的AAV样本的滴度值。
• 我们还通常通过两种qPCR方法来量化AAV样本，并比较数值以确定准确性和可靠性。当这样做时，我们要判断这两个效价值是否在测定的误差范围内，因此是可靠的，或者样品是否需要再次定量。

本文还讨论了qPCR法测定的一些问题ddPCR技术（Hindson等人，2011年，Hindson等人，2013年)，该方法已被证明比qPCR (泰勒等人，2017年）.然而，由于纯化的AAV制剂含有相似且低水平的背景蛋白和化学成分，ddPCR可能不是qPCR的改进(泰勒等人，2017年）.

Addgene AAV滴度对你的实验意味着什么?

由于(物理)AAV滴度是近似的，它们高度依赖于所使用的实验条件，因此不应该对不同来源的样品的滴度值进行比较。如果在同一实验中使用不同来源的AAV，请考虑同时retitering AAV在您的实验室。绝对滴度值可能没有相对滴度值那么重要。最后，由于物理效价不能说明感染效价，考虑对每批AAV进行滴定在活的有机体内确定最佳用量。在Addgene，我们不保留批次，但如果你重新订购同样的病毒，请随时给我们发邮件，我们会尽最大努力给你发送特定批次(如果我们还有可用的批次)。

参考文献

1.Fagone, Paolo等。自互补腺相关病毒载体定量聚合酶链反应滴定的系统性错误和改进的替代方法188完整比分直播人类基因治疗，B部分:方法23.1(2011): 1 - 7。PubMedPMID: 22428975．公共医学中心PMCID:PMC3640491．

2.格林，D，等。通过一种新型衣壳酶联免疫吸附测定AAV-2粒子:基因组包装可限制重组AAV-2的生产。基因治疗6.7(1999)。PubMedPMID: 10455443．

3.等。"用于DNA拷贝数绝对定量的高通量液滴数字PCR系统"分析化学83.22(2011): 8604 - 8610。4.经液滴数字PCR和模拟实时PCR的绝对定量分析。2013 Oct;10(10):1003-5。PubMedPMID:22035192．公共医学中心PMCID: PMC3216358．

4.洛克，马丁等人。2型重组腺相关病毒标准品的特性人类基因治疗21.10(2010): 1273 - 1285。PubMedPMID: 20486768．公共医学中心PMCID: PMC2957240．

5.泰勒，肖恩·C，吉纳维芙·拉派里埃和雨果·日尔曼。“液滴数字PCR与qPCR用于低丰富目标的基因表达分析:从无意义变量到发表质量数据。”科学报告7(2017)。PubMedPMID: 28546538．公共医学中心PMCID: PMC5445070．

6.王峰，等。“一种可靠可行的AAV载体定量pcr方法。”医学监测基础研究19(2013): 187。PubMedPMID: 23828206．公共医学中心PMCID: PMC3706409．

7.Zeltner, Nadja等人。“以野生型AAV近乎完美的传染性作为重组AAV载体传染性的基准。”基因治疗17.7(2010): 872 - 879。PubMedPMID: 20336156．公共医学中心PMCID: PMC2900506．

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