本文由特邀博主Katrin Michel贡献。
Cre-lox是一种非常流行和强大的位点特异性重组酶(SSR)系统，但它只给你一个不经修改的单一控制水平——Cre存在或不存在。cre介导的位点特异性(通常是细胞型特异性)控制DNA重组和基因表达的可能性可以通过与其他SSR系统FLP-FRT的协调使用来推进。此外，还开发了多种时空调控FLP和Cre表达的手段。继续阅读，了解更多关于FLP- frt, creo -lox，以及FLP和Cre的组合如何实现额外水平的遗传控制。
什么是FLP FRT，它是如何工作的?
FLP重组酶是从酵母中衍生出来的，以其逆转或“翻转DNA”的能力命名酿酒酵母（格罗诺斯塔斯基和萨多夫斯基，1985年)。FLP系统的工作方式与Cre系统相似。FLP重组酶识别FRT位点，并在这些位点之间启动位点定向基因重组。FRT位点和loxP位点在核苷酸水平上有所不同，但共同具有13个碱基对回文重复序列的整体结构，中间有一个8 bp的不对称核。这些位点之间的重组可以以类似于loxP位点之间的方式导致DNA的切除、倒置和易位(详情见Cre-lox博客)。
利用智能工程优化FLP FRT
不同的FLP版本-使FLP有效
发现的FLP第一个版本的最适温度为30°C，因此在哺乳动物细胞中效率低下(通常在37°C生长)。智能分子进化导致FLPe的最适温度为37°C (布赫霍尔兹，安格兰德和斯图尔特1998年)。通过添加一个核定位序列(SV40 Large T核定位序列)，并从CAGGs启动子中表达FLPe，进一步提高了FLPe的性能。但FLPe的效率仍低于Cre重组酶。FLPe密码子优化得到FLPO，其效率与Cre (Kranz等人，2010年)。
在你的实验中决定是使用creo -lox还是FLP-FRT系统时，记住重组酶效率的这些差异是很重要的。
Flex矢量中FRT和loxP位点的突变-只反转一次
所有由FLP或Cre介导的重组事件都是可逆的。虽然loxP/FRT位点侧的DNA片段的切除比它的再引入更可取，倒置和再倒置发生的概率是相同的。感兴趣的DNA序列的连续反转可能导致该序列内的基因表达不良，因此应该加以防止。
loxP和FRT的目标位置都经过了设计，以避免这种再反转问题。设计成为可能FLEx向量(翻转切除载体)，当它被发现不是精确的非对称靶点核心序列，而是它的8 bp长度对Cre和FLP功能至关重要时，只允许一个反转事件。由于在FLEx载体中，重组只能发生在相同序列的靶位点之间，因此需要倒置的DNA序列两侧有两对序列不同的靶位点。序列相同的两个靶点之间的重组导致侧翼DNA序列和靶点内部的倒置。在第二步中，将两个相容的靶位点分离出来，留下一个带有反向DNA的载体，其两侧是不相容的靶位点(Schnütgen等2003年)。
Flex向量革新了神经科学
神经元网络中特定细胞类型的操作
表达光诱导离子通道的双反向矢量(质粒# 20298已经彻底改变了神经科学。它们是瞄准和操纵特定细胞类型的唯一手段(数量)在活体动物的神经网络中。来完成这种特定于细胞的操作在活的有机体内，在Cre重组酶控制下表达光激活离子通道的FLEx载体与只在感兴趣的细胞类型中表达Cre的小鼠系结合使用(Atasoy et al. 2008;卡丁等人，2009年)。
配体调控重组酶-保持Cre out直到需要
但是，当重组只发生在一个特定的时间点时，我们能做什么呢?为了实现时间控制，配体调控的Cre和FLPe重组酶被开发出来。实现配体控制的常用方法是将突变的雌激素受体(ER)配体结合域(LDB)融合到FLP或Cre的c端(pCAG-CreERT2 # 14797)。这些Cre/ FLP版本保留在细胞质中，直到加入雌激素受体配体三苯氧胺。然后三苯氧胺结合到融合的ER-LDB域，允许Cre/FLP转位到细胞核，在细胞核中发挥重组酶活性(Logie和Stewart, 1995年；Metzger等人，1995年)。
将活的大脑中的单个神经元形象化
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图1:在Cre重组酶控制下，质粒混合标记神经元形态(eYFP)和突触蛋白PSD95 (PSD95-mcherry)。在子宫内电穿孔后，质粒混合导致皮质神经元及其突触的稀疏标记。 |
如何在活体大脑中标记单个神经元及其突触?特定大脑区域的细胞可以被在子宫内电穿孔。为了实现单个神经元的稀疏标记，可以减少质粒的数量以降低转染效率。然而，如果一个神经元及其突触的细胞结构应该同时从两个不同的质粒显示出来，这种方法就会出现问题，因为它降低了神经元被两个载体转染的概率。Flex向量是解决方案。
表达荧光细胞质标记(如eYFP)和突触蛋白(如PSD95-mcherry)的Flex载体与表达所需重组酶的低浓度载体联合使用。高浓度的FLEx载体保证了大多数细胞都转染了所有的标记质粒，而低浓度的重组酶则限制了其在单个细胞中的表达。利用这项技术，神经科学家可以看到单个细胞的完整树突，以及它的所有突触，以及随着时间的推移，这些突触是如何在活的大脑中重新排列的(Villa et al. 2016)。
梳理FLP和Cre进行额外控制
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图2:形态标记物(eYFP)和突触标记物(PSD95-mcherry)在Flp重组酶和可诱导的Cre重组酶(CreERT2)控制下的表达，显示条件敲除小鼠的单个神经元及其突触。注射三苯氧胺诱导crea - ert2重组酶，导致loxP位点重组，从而敲除基因。在这个实验中，可以比较基因敲除前后的神经元形态和突触连通性。 |
科学家总是追求更多。为了分析单个蛋白在神经元回路或突触重塑中的功能，研究人员将Cre和FLP重组酶结合，控制目标基因的敲除和单独基因的表达。在这些小鼠系中，基因敲除可以通过Cre重组酶表达诱导，而后续实验所需的蛋白(如细胞追踪)可以通过FLP-FRT进行控制。为了进一步的时间控制，三苯氧胺诱导的Cre版本可以用于这些实验。这种Cre、FLP和诱导系统的完美结合，使研究人员能够在特定时间精确控制特定细胞中多个基因的表达。
非常感谢我们的客座博主，Katrin Michel!
卡特琳·米歇尔(Katrin Michel)是麻省理工学院(MIT)的博士后研究员，她对基因和蛋白质如何协调数十亿神经元，形成人类大脑的功能网络的问题非常着迷。
确认:
通过与吉诺威的合作，我们能够分销含有FLEx技术的材料。读了genOway新闻稿为更多的信息。
参考文献
1.Atasoy, D.， Y. Aponte, H. H. Su和S. M. Sternson. 2008。“FLEX开关将通道视紫红质-2定位到多种细胞类型，用于成像和远程电路映射。”神经科学杂志》上28(28): 7025 - 30。PubMedPMID:18614669．公共医学中心PMCID: PMC2593125．
2.布赫霍尔兹，F, P O anggrand和A. Francis Stewart, 1998。“FLP重组酶通过循环突变进化的改进性质”。自然生物技术16(7): 657 - 62。PubMedPMID: 9661200．
3.Cardin, Jessica A. et al. 2009。"驱动快速尖峰细胞诱发伽马节律并控制感官反应"自然459(7247): 663 - 67。PubMedPMID: 19396156．公共医学中心PMCID: PMC3655711．
4.格罗诺斯塔斯基，R M, P D萨多夫斯基，1985。酿酒酵母2微米质粒FLP重组酶通过磷酸酪氨酸连接共价连接到DNA分子与细胞生物学5(11): 3274 - 79。PubMedPMID: 2427927．公共医学中心PMCID: PMC369144．
5.Kranz, Andrea et al. 2010。基于FLPo重组酶的改进的C57Bl/6 FLP缺失小鼠《创世纪》48(8): 512 - 20。PubMedPMID: 20506501．
6.Logie, Colin, and A Francis Stewart, 1995。“Ligand-Regulated因地制宜重组。”Proc。国家的。学会科学。美国92(6): 5940 - 44。PubMedPMID: 7597057．公共医学中心PMCID: PMC41617．
7.Metzger, D, J Clifford, H Chiba, and P Chambon. 1995。使用配体依赖的嵌合Cre重组酶在哺乳动物细胞中的条件位点特异性重组美国国立科学院科学研究所92(15): 6991 - 95。PubMedPMID: 7624356．公共医学中心PMCID: PMC41457．
8.Schnütgen, Frank et al. 2003。“在小鼠细胞水平监测cre介导重组的定向策略”。自然生物技术21(5): 562 - 65。PubMedPMID:12665802．
9.维拉，Katherine L. et al. 2016。抑制性突触在体内持久位点反复组装和移除神经元89(4): 756 - 69。PubMedPMID: 26853302．公共医学中心PMCID: PMC4760889．
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
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- 找到Cre-Lox质粒
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