CRISPR核酸酶的选择:位点的可及性、特异性和敏感性

2016年1月，我们首次发表了一篇博客文章，标题为:我的CRISPR实验应该选择哪个Cas9 ?三年的时间飞逝而过，但从那以后，科学家们对CRISPR核酸酶进行了调整，以满足更多具体的研究需求。在本次更新中，我们将重点关注最新的进展，以及这些变体如何适合您的特定研究问题。

选择Cas核酸酶时的注意事项

当为你的实验选择Cas9核酸酶时，有三个重要的因素要考虑:位点可及性、特异性和敏感性。

网站的可访问性

位点可达性是一种衡量哪些基因组序列可以被Cas9靶向的方法。这是由核酸酶识别的PAM序列决定的。对于最常用的Cas9，来自spCas9酿脓链球菌，这个序列是3 ' -NGG。但在其他物种中发现的Cas9s可以识别多种不同的PAM序列。研究人员还利用实验进化来开发具有更广泛PAM特异性的cas9，允许针对以前无法获得的位点。

特异性

特异性是对Cas9脱靶活性的评估。当Cas9裂解一个不完全匹配的位点时，就会发生这种情况指导RNA(gRNA)用于靶向感兴趣的基因组位点。由于这些脱靶效应可能是全基因组的，在某些情况下，很难确定，脱靶裂解的潜力应该是任何实验中的一个重要考虑因素。

灵敏度

Cas9的敏感性通常与特异性密切相关。灵敏度是衡量Cas9核酸酶靶上活性的一种方法。这可以通过测量目标位置的indel频率来确定。特异性比率可以通过计算靶上活性除以靶外活性来测量。

位点可及性增强的Cas9核酸酶

为了在特定的位置产生基因组改变，它必须被Cas9访问。我们之前的博客文章PAM要求与CRISPR在SpCas9之外的扩展描述了从不同微生物中分离的Cas9s的PAM特异性工程Cas9变体能够以不同的PAM位点(NGG、NGAN、NGG、NGAG和NGCG)为目标。从那以后，Osamu Nureki实验室描述了一个合理设计的Cas9，SpCas9-NG,这只需要二核苷酸PAM NG（Nishimasu等人，2018）．David Liu实验室也有类似的描述xCas9，显示出靶向多个PAM序列(NG、GAA和GT)的能力，大大增加了可靶向的基因组位点数量(胡等人，2018）．

由于其严格的PAM特异性，这些改变的变异可以靶向你感兴趣的基因组位点，而野生型Cas9可能无法接近这些位点。这一点尤其重要基本编辑在这种情况下，Cas9必须指向一个非常具体的位置。

在你的实验中选择Cas9的特异性和敏感性

CRISPR的抽屉里。太多的选择!漫画作者Maya Kostman。

选择Cas9的另一个重要考虑是平衡特异性和敏感性。野生型Cas9表现出高的靶上活性，但也有高的脱靶活性，这在许多应用中可能是不希望的。在我们第一篇关于选择Cas9的博客文章中，张峰实验室描述过eSpCas9而基思·荣格实验室则开发了SpCas9-HF1．与Cas9相比，两种酶的脱靶活性均降低。从那时起，荣格和詹妮弗杜德纳实验室使用定向突变技术来生成超精确的Cas9 (HypaCas9）．与eSpCas9和SpCas9-HF相比，该核酸酶在多个不同位点表现出较低或相似的脱靶活性。安娜·塞雷塞托实验室使用随机和定向诱变的方法pX-evoCas9它们还显示出了更高的特异性。

最近，Jungjoon Lee实验室使用定向进化来生成Sniper-Cas9导致特异性提高的Cas9。他们使用不同长度的grna比较了Sniper-Cas9与不同Cas9变体的现场和场外活性(Lee et al.， 2018))，发现Sniper-Cas9在大量位点和gRNA长度上表现出高度的特异性和敏感性。

Cas9的最新替代品

虽然Cas9仍然是应用最广泛的CRISPR核酸酶，但最近的研究表明，其他酶可能更适合特定的实验方法。一个例子是CasX它的特色是奥克斯和杜德纳实验室(Doudna Labs)，它们都很小，可能不太可能引发强烈的免疫反应，这些因素可能使它特别适合在活的有机体内研究和潜在的治疗。Cas12b，其特点是张(Strecker等人，2019年),李(Teng et al.， 2018)拉布拉多犬也显示出良好的前景在活的有机体内由于其体积小，且相对于Cas9具有特异性，研究人员对其进行了研究。随着科学家继续从各种来源描述CRISPR核酸酶的特征，研究人员可用的工具箱可能会继续扩大。

最终的想法

自从Cas9首次用于基因组工程以来，有越来越多的Cas酶和变体可供选择。虽然没有一种酶适合所有的实验方法，但了解每种Cas酶的优点和局限性有助于确定使用哪种酶。请记住，在为您的实验选择Cas蛋白时，可访问性、特异性和敏感性是关键考虑因素。

参考文献

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