最初发布于2017年11月30日，更新于2020年7月31日。
Cas13酶正迅速成为CRISPR领域的主要参与者。就在张峰的实验室鉴定一年后Cas13a（C2c2）（Abudayyeh等人，2016）作为一种RNA靶向CRISPR酶，它们适用于精确RNA编辑的Cas13b（Cox等人，2017年）。这一新系统称为修复（RNA编辑用于可编程A到I（G）替换）是第一个用于RNA编辑的CRISPR工具。两年后，实验室发表了一篇关于RNA编辑器的论文，该编辑器允许C到U编辑（RESCUE）。我们将介绍这些工具是如何开发的，以及您可以在研究中使用这些工具的潜在方式。
RNA编辑优势
与更传统的DNA编辑系统相比，RNA编辑具有多个优势;首先，不需要RNA编辑同源定向修复（HDR）Cas13酶也不需要靶基因座上的PAM序列，使它们比Cas9/Cpf1更灵活。一些Cas13酶更喜欢具有给定单碱基原间隔基侧翼位点（PFS）的靶基因序列，但LwaCas13a等直系同源基因不需要特定的PFS。Cas13酶不包含负责DNA切割的RuvC和HNH结构域，因此它们不能直接编辑基因组。基于Cas13的RNA编辑系统可能是可逆的，并且可以避免通过DNA切割引入基因组偏离目标或INDEL非同源端连接(NHEJ).
设计RNA编辑器
张的实验室设想了一种双组分RNA编辑器:将Cas13酶融合到RNA腺苷脱氨酶(ADAR)中。这样的系统可以将腺嘌呤转化为肌苷，而转译机制就像鸟嘌呤一样处理肌苷。这种RNA编辑器将允许RNA中的点突变，这可能重演或挽救已知的致病等位基因，或引入过早的终止密码子使RNA失去功能。
为了构建一个强大的RNA编辑器，实验室从Cas13支架开始，测试了多达21个Cas13a直系同源体、15个Cas13b直系同源体和7个Cas13c直系同源体。他们希望找到一种稳定折叠的直系同源体，它能有力地切割RNA，不像LwaCas13a，LwaCas13a必须由单体超折叠GFP稳定，平均只有约50%的RNA敲除。在初始测试中，Cas13b来自普氏菌9月。P5-125（pPCAS13b）产生62.9%的平均敲除，他们选择这种酶进行进一步研究。pPCAS13b不需要PFS，并且它对来自30 nt靶序列的碱基12-26的靶RNA错配敏感。
对于蛋白质的编辑部分，他们检测了ADAR1和ADAR2，它们将RNA中的腺苷脱氨基为肌苷，从而产生功能性a->G变化。他们将ADAR脱氨酶结构域（ADARDD）与dPspCas13b融合，但观察到低RNA编辑。为了增加A->G编辑，他们采用了超活跃的ADAR结构，如ADAR2DD（E488Q）。他们还通过在要编辑的目标a的对面引入一个C来调整指导RNA的结构。此更改指定当gRNA间隔区中存在多个As时进行的编辑，因为如果模板在该位置存在胞嘧啶错配，ADAR将优先编辑腺嘌呤。
PspCas13b-ADAR2DD（E488Q）显示了具有30-84个核苷酸的不同间隔长度的稳健编辑，并指定该系统为REPAIRv1。使用下一代测序，他们确认了A->I编辑，发现50个nt间隔增加了编辑效率，但也增加了目标窗口内的非目标编辑，可能是由于双链RNA的较长延伸通过对ADAR2DD催化突变体的研究，他们发现编辑是由ADAR2DD介导的，而不是由PspCas13b介导的。
测试和改进Cas13b修复系统的RNA编辑
为了测试REPAIRv1的稳健性，实验室从ClinVar数据库中针对34个致病性G->A突变。他们成功地编辑了33/34个位点，在HEK293T细胞中的编辑效率最高为28%，使用RNA-seq进行评估。由于REPAIRv1机制太大，无法放入腺相关病毒载体中，他们测试了截断的adards，看看是否可以缩小结构。他们确定了ADAR2DD（delta984-1090），它在不降低编辑效率的情况下，将REPAIRv1结构大小从4473 bp减少到4152 bp。188完整比分直播
尽管REPAIRv1基因敲除比shRNA基因敲除更精确，但它仍然显示出大量的脱靶活性。通过突变ADAR2中与双链RNA相互作用的残基，他们希望破坏ADAR-RNA结合以减少脱靶。在测试的结构中，ADAR2DD（E488Q/T375G）(修理2)的对靶效率最高，脱靶编辑量最低。在一次直接转录组范围的比较中，REPAIRv2将脱靶位点从用REPAIRv1观察到的18,385个减少到仅20个。
通过RESCUE扩展RNA编辑能力
两年后，Zhang实验室扩展了RNA编辑工具包，允许使用他们的拯救(RNAE编辑特定的C-to-U交换)系统（Abudayyeh等人，2019年）。为了避免天然胞苷脱氨酶RNA编辑的一些固有缺陷，他们进化出腺嘌呤脱氨酶ADAR2DD来脱氨酶胞苷，并使用dRanCas13b（催化活性Cas13）以胞嘧啶脱氨酶为靶点。对与RNA底物接触的ADAR2DD残基进行三轮合理诱变，产生15%的C-to-U编辑活性。然后，他们在整个ADAR2DD上进行16轮定向进化，以进一步优化胞苷脱氨酶活性。虽然RESCUE可以进行C-to-U编辑，但作者注意，它保留了腺嘌呤脱氨酶的能力。
然后，作者测试了RESCUE系统编辑内源性转录本的能力，发现编辑效率高达42%。他们注意到，当C或U基地在目标基地对面翻转时，救援在30 nt指南中最为活跃。然而，他们发现除了有针对性的C-to-U编辑外，RESCUE还对目标核苷酸进行了A-to-I非目标编辑。在指南中引入鸟嘌呤错配，与这些偏离目标编辑相反，有助于通过RESCUE将局部偏离目标编辑降至最低。为了解决在全转录组RNA测序中观察到的C-To-U和A-To-I转录组广泛偏离靶点的效应，作者进行了合理的诱变，并鉴定了RESCUE中的S375A突变（命名为救援-S)提供了~76%的目标c - u编辑，同时减少了~45%的脱靶c - u编辑和~94%的脱靶a - i编辑。
针对RESCUE在治疗应用中的潜在用途，作者测试了各种dRanCas13b截短，这将允许包装该结构以用于病毒递送。他们发现，在一个小到足以进行病毒传播的救援系统中，C-末端截短允许相同或改进的编辑能力。
未来方向
在Cas13之前的RNA靶向工作的基础上，REPAIR是第一个基于CRISPR的系统，能够实现精确的RNA编辑。RESCUE的加入进一步扩展了RNA编辑工具包和可编辑序列。如上所述，编辑RNA的能力具有多重优势，包括可逆性和用于非分裂细胞。随着两种系统的靶向能力的增强，作者们期待着RNA编辑在研究中的广泛应用及其潜在的治疗用途
我们也很好奇，修复和救援是否可以以多路复用的方式编辑多个RNA。很明显，CRISPR RNA编辑器将为科学研究打开新的大门——您将如何在研究中使用这些系统？
Cary Valley为更新本文做出了贡献。
参考文献
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