这篇文章是由客座博主Fredrik Wermeling贡献的瑞典卡罗林斯卡学院索尔纳医学院分子医学中心(CMM)的一个研究小组。
设计5个引导rna (gRNAs)，针对你想在下一次研究的1000个基因中的每一个，可能是非常耗时的CRISPR屏幕．幸运的是,绿色的上市软件可以帮助你做到这一点，可能不到一分钟(1）.
Green listing是一种新的软件工具，用于设计针对用户提供的(长或短)基因列表的定制CRISPR筛选的grna。这种方法对于下面将要讨论的几个应用程序是有用的。该软件还可以作为一个简单的工具，快速找到一个或几个世界级CRISPR实验室建议有效的grna。
CRISPR敲除筛选:全基因组筛选与定制筛选
全基因组CRISPR敲除筛选已经在几种情况下使用，是公正发现的极好的工具。通过这些筛选，研究人员生成了一个细胞群，其中所有基因在群体水平上被剔除，但每个细胞最多只有一个基因被剔除。在这个基因异质性的群体中，细胞行为不同(例如不同的生长特性、迁移能力或其他可以在单细胞水平上有效测量的表型)，通过细胞分类等方法进行分离。分离的细胞随后被下一代测序，以确定哪些grna在不同的组中有差异表达，因此，哪些基因是参与研究表型的良好候选基因。
为了筛选的稳健性，每个基因不是只有一个gRNA靶向，而是对每个基因使用许多不同的gRNA。目前，13个全基因组SpCas9敲除文库由不同的学术实验室设计，针对小鼠、人类、黑腹果蝇,弓形虫可通过www.addgene.org/crispr/libraries/．其他的库也可以从商业供应商处获得。这些库通常包含4-12个gRNAs/基因，这导致库包含多达20万个不同的gRNAs。有人建议，研究人员在一次筛选中应该使用比gRNA多~400X倍的细胞，以确保每个gRNA都有很好的机会参与筛选。最终，实验结果可能需要8x10以上的空间7成功的目标细胞。根据所使用的单元格和读数，这可能是一个主要的限制。
全基因组CRISPR筛选方法的另一种替代方法是使用针对基因子集的更小的文库。使用这种方法，您将失去找到不需要的东西的无偏潜力，但降低屏幕的复杂性也有好处。例如，分析变得更容易，所需的细胞数量更少，也许最重要的是，如果你正在处理一个定义明确、假设驱动的研究问题，瞄准所有基因不一定会增加价值。
自定义CRISPR屏幕的例子
差异表达基因
随着像RNAseq这样的全球基因表达分析的成本越来越低，研究界正在产生大量的描述性转录组学数据。针对差异表达基因设计的定制CRISPR屏幕可能是弄清这些数据意义的下一个阶段。这些靶向筛选可以让研究人员测试在基因表达数据集中发现的差异表达基因中，哪些是引起表型兴趣的原因。
选择的路径
当我还是博士生的时候，我参加了一个很棒的演讲。其中有一张幻灯片给我留下了深刻的印象。这张幻灯片显示了一个由许多受体、信号分子、转录因子和配体组成的复杂信号通路。主持人随后展示了他们为敲除小鼠产生的基因(我记得所有相关的基因)。然后，实验室用这些敲除小鼠来证明已知通路中哪些成分对不同配体的活性是必需的。这些知识对于药物发现、分析复杂的信号通路以及识别通路的哪一部分需要抑制或阻断细胞对特定配体的反应(例如当微生物或细胞因子的成分被添加到细胞中)非常有用。通过定制CRISPR筛选和适当的表型读出，类似的定位可以通过定位信号通路的所有潜在成分快速完成。例如，可以研究细胞对一种已知能引起重要表面蛋白上调的细胞因子的反应(例如癌细胞上的PD-L1)。在这种筛选中，已知的细胞因子信号通路的成分可以被靶向。刺激后未上调蛋白的细胞将被分类分离，然后进行测序，以确定哪些信号分子参与了表型。
表面蛋白
我的小组在不同情况下对免疫细胞有效。我们研究的大多数免疫细胞都是迁移的，它们的精确定位对它们的功能至关重要。它们的迁移是由它们与环境的各种相互作用引起的。这些类型的相互作用在很大程度上涉及细胞表面表达的受体。因此，一种筛选可以用来靶向表面蛋白质，以确定哪些接触点参与了研究的细胞行为。这种方法特别适合于在活的有机体内CRISPR修饰的细胞被转移到动物体内，并跟踪转移细胞的行为。使用表面蛋白质的一个好处是，这种蛋白质很容易在活细胞中使用抗体进行研究。抗体可以进一步用于干扰已识别的表面蛋白，这样的抗体可能会成为有趣的药物。
已知的药物靶点
另一种有趣的方法是针对已知的可药物靶点设计筛选，首选那些已被验证的抑制剂或甚至已被批准的药物。如果你幸运地发现一种可药物治疗的基因在你的身体系统中起着核心作用，你就可以大大加快进入临床试验的进程。
二次屏
如果你已经从全基因组筛选中生成了候选基因列表，那么一种更小的、次要的CRISPR筛选可以用来验证候选基因列表。Green Listed，截至目前，包含了通过Addgene获得的大部分完整的人类和小鼠基因组敲除文库。这意味着您可以使用来自的一个库执行一个屏幕Addgene，然后使用Green Listed设计一个更小的验证屏幕，使用从相同或其他库中提取的选定grna。
这些不同的方法也可以结合使用。例如，你可以设计一种针对已知药物靶点的所有差异表达基因的筛选，或者针对编码表面蛋白的所有差异表达基因的筛选。
使用自定义筛选方法的第一个挑战是确定合适的基因列表以作为目标。因此，如果你需要帮助整理你的清单，和生物信息学家保持密切联系总是一个好主意。一旦你有了你的基因列表，绿色列表可以帮助使gRNA设计过程快速和容易。
绿色列出- CRISPR屏幕工具
“绿色名单”是一个基于网络的免费软件工具http://greenlisted.cmm.ki.se/．Green Listed可用于设计上述所有目的的grna。请查看网站上的视频和文字，了解更多关于如何使用该软件的详细描述。以下是该软件如何使用的简要概述:
- 设计一种易于测量的细胞表现型的筛选(例如癌症细胞作为细胞毒性药物添加)，并决定你想测试哪些基因的表型效应。通常会研究表现型在体外但在表演方面有巨大的潜力在活的有机体内筛选，研究影响动物模型系统细胞行为的基因。
- 使用绿色列表提取的grna，目标您的选择基因列表。首先选择你想在屏幕上使用的“参考库”。目前，已有11个已出版的图书馆嵌入其中。这些都是由六个不同的研究机构慷慨捐赠的:Doench/Root (2)、张(3.),吴(4), Yusa (5),王/着陆器/萨巴蒂(6)、查里/马里/教会(7）.这些参考文库包含多个针对指定物种的所有基因的grna，被储藏实验室认为是最好的grna。不同的实验室使用不同的算法来计算哪种是最好的grna。有趣的是，这些库并没有重叠太多，这表明我们在最佳gRNA设计上还远远没有达成共识。有了“绿色列表”，你也可以很容易地从几个库中提取相同基因的gRNAs，并识别那些被几种算法“绿色列表”的重叠gRNAs。在使用每个参考图书馆之前，请阅读“详细信息”文本，以了解它们是如何设置的。使用“用户上传”选项，您还可以选择上传自己最喜欢的参考库，例如与SpCas9之外的策略相关的，或目前未列入绿色列表的物种。
- 在“输入”框中，用屏幕提供你想要瞄准的基因列表。
- 从不同的“选项”中进行选择，包括添加用于克隆目的的适配器序列。
- 按下run并等待生成包含多个文件的输出文件夹。这些包括:
输出:一个文本文件，包含关于建议使用的grna的完整信息，包括原始参考库中提供的所有信息，以及GC%、反向恭维序列等。
Output_Compact:一个文本文件，描述哪些基因被包括在内，以及每个基因有多少grna被识别。该文件可用于快速获得生成的grna列表的概述。
Output_Short:一个压缩文本文件，包含每个gRNA的完整名称和简短名称，以及建议的gRNA序列(包括适配器)。
Output_UserInputParams:包含您在web界面中输入的所有信息，方便您稍后确定您是如何设置实验的。
Output_NotFoundList:如果在参考库中没有找到您所要求的基因，则会出现一个文本文件。基因有不同的名称并不罕见，而且该软件只能使用选定的参考文库使用的名称提取基因的gRNAs。如果这种情况发生在你身上，一个解决方案是确定你感兴趣的基因的所有替代名称(Green listing没有找到的)，并测试是否有任何替代名称更好。为了实现这一点，你可以复制你的基因从维基百科页面的“别名”列表，并粘贴到绿色列表。
注意，输出文本文件可能很难阅读。建议您打开上面的文本文件，复制文件的内容，并粘贴到excel中。然后信息按行和列排列，这更容易阅读。
- 订购建议的gRNA寡聚物，最好是寡聚物池。一些合成oligos的公司甚至会直接接受Output_Short文件。我们使用CustomArray公司为这个目的。
- 随后，使用您指定的适配器序列将gRNA寡聚体克隆到您所选择的向量中。
- 运行您的屏幕!
最后请注意
我非常感谢研究人员让我们使用他们的参考图书馆，从而使它可能把这个软件。对我来说，这是CRISPR社区非常开放和慷慨的一个很好的例子。它表明，当我们共享知识和试剂时，科学可以大大加速。我并没有有意将任何库排除在软件之外，我希望继续包括其他库。到目前为止，我主要研究人类和小鼠SpCas9基因敲除文库，但当然也有针对其他物种的伟大文库，以及使用与其他核酸酶相关的策略以及抑制和激活方法的文库。
非常感谢我们的客座博主Fredrik Wermeling!
Fredrik Wermeling在瑞典卡罗林斯卡医学院索尔纳的分子医学中心(CMM)有一个研究小组。他对利用分子工具研究免疫系统和癌症特别感兴趣。更多信息可通过以下途径找到https://wermelinglab.com/．
参考文献
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2.杜恩奇等。“优化了sgRNA设计，以最大化CRISPR-Cas9的活性和最小化脱靶效应。”自然生物技术34.2(2016): 184 - 191。PubMedPMID: 26780180．公共医学中心PMCID: PMC4744125．
3.Sanjana, Neville E, Ophir Shalem, Feng Zhang。“用于CRISPR筛选的改良载体和全基因组文库”自然方法11.8(2014): 783 - 784。PubMedPMID: 25075903．公共医学中心PMCID: PMC4486245．
4.马宏明，等。“基于crispr的筛选确定了西尼罗病毒诱导的细胞死亡所必需的基因。”细胞的报道12.4(2015): 673 - 683。PubMedPMID: 26190106．公共医学中心PMCID: PMC4559080．
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6.Wang, Tim, et al. .“基因本质图谱揭示了基因网络和与致癌Ras的合成致死相互作用。”细胞168.5(2017): 890 - 903。PubMedPMID:28162770．公共医学中心PMCID: PMC5445660．
7.Chari, Raj等人。“通过库对库的方法解开CRISPR-Cas9基因组工程参数。”自然方法12.9(2015): 823 - 826。PubMedPMID: 26167643．公共医学中心PMCID: PMC5292764．
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