最后一次更新于10月1日，2020年10月1日由Aliyah Weinstein。
这篇文章由客人博客贡献，以荣秦和郝喻王。
CRISPR / CAS9.正在彻底改变老鼠基因靶向领域。长期以来，老鼠在实验室里非常有用——它们体积相对较小，易于操作，是研究哺乳动物生物学的首选。与任何模型一样，小鼠也并非没有问题，但多年来使用它们已经积累了大量的遗传和生理数据。事实上，老鼠研究的未来是光明的，因为现在使用CRISPR/Cas9操纵老鼠基因组比以往任何时候都更容易。
类似于人类基因组，小鼠基因组由3×10组成9.核苷酸(nt)，并编码大约23,000个基因。如果我们能够快速地操纵单个老鼠的基因并研究它们在健康和疾病中的功能，那将是非常棒的，但直到最近，这并不是那么容易。20世纪80年代，人们发明了基因靶向技术，将特定的变化引入小鼠基因组。利用这些早期技术，研究人员首先将一种突变引入小鼠胚胎干细胞(ESC)系，富集并选择已成功包含所需突变的细胞，然后从这些工程ESCs中获得小鼠。为此，将转基因ESCs注射到发育中的小鼠胚胎中，使这些胚胎发育成嵌合小鼠(成年小鼠中有一部分细胞来自转基因ESCs)，并与嵌合成鼠交配产生完全转基因的后代。尽管这项技术功能强大，但使用起来很麻烦，效率不高，通常需要一年多的时间来生成一个鼠标模型，而且它的成功并不总是能保证的。
要了解有关此过程的更多信息，请查看我们的鼠标建模博客帖子：第一部分:转基因老鼠和第2部分:繁殖和杂交小鼠。
我的第一个Crispr鼠标实验
一切都随着2013年的克里克尔的出现而改变（琮等。，2013年）！当他将这项新技术与工程师鼠标模型使用这项新技术时，他的第一次暴露于Crispr，王等。，2013年那阳等。，2013年）.和世界上的其他人一样，我(Wenning)对CRISPR很着迷，赶紧去测试它。我仍然记得2014年3月16日的那一天，我从CRISPR基因组编辑实验中得到了我的第一个初步结果。我在办公室里打开了一个序列文件。然后我看到了它，色谱图显示了由CRISPR引入的突变的迹象。序列开始时是干净的，然后在运行大约100个bps时，它变得“脏”了，多个序列轨迹相互重叠!当计数结束时，75%的老鼠在这个实验中出现了突变!我望向窗外，看到多尔山和阿卡迪亚国家公园的天际线。我被搞糊涂了。这本来是很难的。 I was mentally prepared to go through a learning curve that would result in success only after many attempts. Was I really successful in my first attempt at using CRISPR?
后来，我发现我的经历被世界上许多人所分享。是的，最后，我们有一种技术，CRISPR，概念简单，使用简单，性能强大。在自然环境下，CRISPR-Cas9是细菌和古菌中的获得性免疫系统。如你所知如果你一直在跟踪188博金宝官网CRISPR基因编辑系统是由CRISPR基因编辑系统衍生而来的酿脓链球菌。另一种Cas9，来自链球菌球菌,是在编辑老鼠胚胎方面的效果和来自S.。pyogenes.并且具有更小的优点（张等人，2016）。为了编辑基因组，CRISPR / CAS系统利用3个组分，指定靶标的Cas9内切酶的Cas9内切酶在靶位点（DSB），如果需要（用于爆炸模型），作为修复材料的供体寡核苷酸或质粒。
CRISPR鼠标模型基础知识
为了创建鼠标模型，将GRNA，CAS9和供体寡核苷酸或质粒组分置于施肥小鼠卵的前核或细胞质中。或者，避免处理胚胎离体，可以将部件电穿孔进入怀孕女性的输卵管，这是一种称为通过产卵核酸的基因组编辑(Gurumurty et al.， 2016)。AAV也可以用作向量将CRISPR/Cas9注入卵母细胞或孕妇的输卵管(尹等人，2018年那Mizuno等人，2018年）.或者，gRNA, Cas9和供体寡核苷酸可以电穿孔到小鼠受精卵(秦等, 2015)。
当在Zygotes内时，GRNA将在3 x 10之间寻找其目标9.在小鼠基因组的基因内容nt和Cas9酶将在目标位点进行切割。当它兴奋时，细胞发出“SOS”信号，细胞修复机制就会冲进来修复损伤。如果他们能做的只是把断了的两端缝在一起异源端加入（NHEJ），这将留下“疤痕”，核苷酸缺失或在破碎的末端添加，因此抑制了基因。但是，如果提供修复材料（以寡核苷酸或质粒的形式），则可以通过该基因组进行精确的变化同源性定向修复途径(HDR)，无论是单个核苷酸的改变，报告基因的插入，或用人类基因替换小鼠序列。
利用CRISPR进行小鼠基因组工程的优势
从一开始，使用CRISPR生成小鼠模型就比传统方法更容易。CRISPR是如此高效，你可以直接将试剂注射到受精卵中，避免了小鼠ESCs提供的富集和选择的需要，这一事实节省了时间和金钱。例如，当产生CRISPR基因敲除模型时，我们通常只筛选15-25只小鼠，并发现许多(如果不是全部)小鼠携带移帧突变。如果用供体寡核苷酸进行敲入，我们的目标是产生50到100只小鼠，而且通常都能成功地获得携带预期突变的小鼠。对于供体质粒，结果难以预测。在我们最好的情况下，我们看到3只小鼠中有2只携带了一个5 kb的ROSA位点的Southern blot检测。
从以上讨论的效率来看，与更传统的方法相比，CRISPR鼠标编辑的4个主要优势。首先，与传统的基因靶向技术相比，该技术可以用于几乎任何品系的小鼠，而传统的基因靶向技术仅限于少数品系，包括129和C57BL/6，我们有生殖系胜任的ESC品系。其次，这个过程要快得多。使用CRISPR技术培育创始人小鼠需要3个月，而传统的基因靶向技术需要8到10个月。它的成本也更低。利用CRISPR技术，培育创始人老鼠的成本可能在5000美元左右，而传统基因靶向技术的成本可能在5万美元左右。最后，与传统的基因组工程方法相比，在产生所需的突变体后代时，CrispRP更有效，85％的成功与ESC（COHEN，2016）相比50％相比。
使用CRISPR生成小鼠模型的缺点
尽管CRISPR非常有用的生成通过与HDR NHEJ和生成小突变,突变时大规模基因组编辑,如更换一只老鼠基因与人类直接同源(大于5 kb),还有待观察是否CRISPR传统基因打靶一样健壮。CRISPR工具最近被用于将一个25 kb的人类基因导入小鼠基因组。然而，只有3.4%的创始者建立了转基因的种系传递，这一技术仍有待改进。此外，在使用CRISPR时，必须注意并非所有grna都是生来平等的。有些人工作得比其他人好。网上有各种各样的资源来指导你的gRNA设计。我们一直在使用Benchling，但还有很多其他提供gRNA设计工具你可以从约翰·多恩奇那里得到一些额外的建议gRNA设计博客帖子。最后，永远记住您正在使用RNA，这易于通过Omnipresent RNase降级。您可能想宣布您的替补席“免费”，并避免与这些试剂一起与朋友和同事交谈。除此之外，对您的微注射者很好，谁拥有提供有效载荷的战略性重要工作！
最后但同样重要的是，当使用CRISPR时，要记住，它最初是在一个鲜为人知的细菌中发现的，我们仍然有很多东西要从各种形式的生物学中学习!
非常感谢我们的客人博主，以文宁琴郝蒂王！
秦文宁是百健公司的分子生物学家，他对CRISPR在小鼠基因组编辑中的应用特别感兴趣。
王浩义是中国科学院动物研究所的教授，他对利用CRISPR开发改善人类健康的治疗应用很感兴趣。
参考文献
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