这篇文章由客座博主贡献贝基库切拉，硕士和埃里克康托尔博士从新英格兰生物学实验室。
金门装配限制
受到合成生物学界的欢迎，金门大会通常用于在一个单一的“一锅”反应中组装2-10个DNA片段，形成复杂的、多插入的模块组装，从而实现生物合成途径工程和优化。然而，对于超过10个模块的组装，当前的最佳实践通常依赖于使用不同的两步层次结构方法IIS型限制性内切酶每个步骤的特殊性。酶效率、稳定性和缓冲液相容性等因素对单步或两步组装造成了实际限制。
我们已通过使用工程改造的IIS型限制性内切酶和由实验衍生的DNA连接酶的保真度数据引导接合序列的仔细选择的减少这些限制。我们的工作表明，现在可以实现与两个强大的效率和准确性20+片段组件。
金门装配包括IIS型限制性内切酶(如BsaI)和DNA连接酶(如T4 DNA连接酶)的同时活动。插入，无论是预克隆的或扩增的形式(如上所示)，在一个方向的BsaI位点的侧翼，导致在切割后5 ' 4个碱基悬垂。在类似的IIS型限制性内切酶切割后，目的载体接受组装，结果在5 ' 4个碱基悬垂与组装的插入物的悬垂互补。插入物连接到载体后，BsaI位点不再存在，允许多个片段按顺序、预先确定的方式组装。如果原始的插入到它的原始载体中，它将随后被重新消化并“符合”连接到目标结构中。反应通常在37°C到16°C之间循环，为限制酶和连接酶提供最佳反应温度，从而增强目标结构的有序组装。
金门装配测试系统的开发
我们的研究主要集中在三个不同层次的装配：
- 高效、准确的单插入组件
- 中间的5-或12片段组装
- 更复杂的24片段组装
单个插入基于由所述目的地质粒采集抗生素选择性标记的测定克隆效率。抗生素选择允许高通量克隆效率测量。我们使用类似尺寸的扩增子LAMBDA插入到控制用于通过抗生素选择背景的任何抑制执行的附加效率的测量。通过菌落PCR转化体的筛选证实了LAMBDA插入件的插入在相同的高频率的抗生素选择标记。
5-， 12-和24-组件系统的基础是正确地装配的lacI / lacZ的盒（由NEB用于装配系统的优化使用而设计），以产生经上LB / CAM / X-gal的/ IPTG生长琼脂平板蓝色菌落表型，表明编码序列的成功重建在β-半乳糖苷的lacI / lacZ的磁带。的准确组件的额外确认是由来自蓝色或白色菌落中分离质粒的测序实现。蓝色菌落测序显示预期的完整序列的的lacI / lacZ的基因(1），而白色菌落的测序显示的误组件和非常偶然的未切割或剪切/再连接目的地PGGA质粒的混合物。
对5-、12-或24-片段测试系统的最终验证是通过建立组装反应来进行的，在组装反应中故意忽略了单个组分。由于任何组装都依赖于每个模块的存在，目的结构和功能IIS型限制性内切酶和DNA连接酶中，任何单一遗漏应该阻止一个完整的组件，其将导致一个蓝色表型的形成。事实上，这被认为在所有lacI / lacZ组件测试系统;如果没有任何单一组分省略得到蓝色菌落。
金门大会的成功放映
所有金门组件采用的装配（插入或模块的数量）的复杂性和所得到的组件（多个转化的）效率之间的反比;插入物的数量越大，转化体的数量越低。为了弥补这一点，研究人员可以镀更大含有转化到选择板的向外生长的卷。从得到的1-图2示出了代表性的转化平板，12-和24-片段组件的lacI / lacZ的盒，以及示出了如何1毫升生长于每个变换板扩散的体积可被操纵，以产生菌落铺板密度的适当水平。
连接酶的保真度和组装效率
五个片段的lacI / lacZ的盒组件是与高水平的转化和低的背景很容易实现 - 以至于几乎没有范围的检测方法的改进。为了进一步推测试系统，我们重新设计为12点24的片段。
这种重新设计是由两个先进的重新设计的原始BSAI-HF®IIS型限制性内切酶以及完成了由Potapov等人在NEB (1那2）。虽然T4 DNA连接酶，生物技术大部分克隆的努力了50多年的中流砥柱，喜欢的结扎沃森 - 克里克碱基对底物，在一些不匹配的配对上表现出显著的活性。在金门装配期间，不匹配的悬挑对的结扎可能导致不正确的装配，因此必须小心，尽量减少这种可能性。最近，NEB的研究人员在标准反应条件下对所有3-和4-碱基悬垂序列的粘性末端连接进行了分析。该数据集允许定量序列依赖的连接效率和识别不匹配倾向的配对。利用这些4 bp的悬垂观察，精确的“高保真”连接集为12和24片段版本的lacI/lacZ盒设计和合成。与BsaI-HFv2 (NEB #R3733)结合，重新设计以提供改进的金门性能，对这些更复杂的组装进行了一系列优化实验。结果发现，高效和准确的装配水平确实是可能的，在99%的12片段组装和超过90%的24片段组装中进行正确的帧内装配(图3，表1)。这些改进(变压器的数量增加了5- 12倍，同时保持了高水平的正确装配)转化为更快的装配工作流程，需要更少的筛选来确认装配的准确性。保真度数据可用于推导类似的高保真悬挑，适用于任何金门组装设计。
| 装配的碎片数 | 金门大会协议*（1毫升生长的体积铺板） | 每个板正确装配 | 装配逼真度(正确百分比) | 计算菌落总数 | ||||||||||||||||||||
| 每2μl的装配反应 | 每个完整装配反应** | |||||||||||||||||||||||
| 1 | 5分钟,37岁ºC(2.5μl) | 687 | 100％ | 274200年 | 2742000 | |||||||||||||||||||
| 1 | 60分钟。,37岁℃（2.5微升） | 1623 | 100％ | 649200年 | 6492000年 | |||||||||||||||||||
| 12. | (5分钟,37岁ºC -> 5分钟，16ºC) x 30 (5 μl) | 245. | 99.5% | 48900年 | 489000年 | |||||||||||||||||||
| 24. | (5分钟,37岁ºC -> 5分钟，16ºC) x 30 (100 μl) | 78 | 90.7％ | 783 | 9792 | |||||||||||||||||||
表1产量和保真度用于与BSAI-HFv2和T4 DNA金门组件连接酶。使用图3所示的生长体积计算每块板组装的效率，计算从组装反应的2µl和整个组装反应构建的整个组装的产量。所有组装反应均在37分钟后末端浸泡5分钟ºÇ孵化或骑自行车。
*装配反应体积为20微升（1，12个片段）或25微升（24个片段）。
汇编的未来
DNA组装方法是许多科学领域的重要工具，研究人员继续在日益复杂的实验条件下测试DNA组装方法的局限性。如本工作所示，构建更复杂的多片段程序集的能力将为推动技术向前发展提供额外的努力。
非常感谢我们的客座博主Becky Kucera, m.s c和Eric Cantor，博士新英格兰生物学实验室。
贝基库希拉是一种的应用及产品开发重点DNA克隆首席科学家开发和组装，新英格兰生物实验室，公司
- 埃里克康托尔是一个分子生物学家和发展组组长监督团队将新产品推向市场，新英格兰生物实验室，公司
参考文献
1.弗拉基米尔，波塔波夫，等。“通过连接序列依赖性的保真度和偏压纹施加组件金门的优化”。bioRxiv(2018): 322297。
2。Potapov, Vladimir等。“一种用于全面分析DNA末端连接过程中T4 DNA连接酶保真度和偏倚的单分子测序方法。”核酸研究（2018）。PubMed.PMID: 29741723。PubMed中心PMCID：PMC6061786。
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话题：质粒克隆那分子生物学协议和提示那质粒
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