热质粒- 2020年6月-条形码CRISPR文库，稀疏细胞标记，钙调磷酸酶报告和DNA染色染料替代

通过各种Addgenies

各种Addgenies2020年6月2日

每隔几个月，我们通过我们的118金宝搏抽水．这些文章提供了最近质粒沉积的简要总结，我们希望它们将使您更容易找到和使用您需要的质粒。如果你想写关于最近的质粒沉积请注册在这里．

All_Flames

人类全基因组sgRNA iBAR文库

文章提供的苏珊娜Bachle

图1:使用sgRNA进行crispr联合筛选的初始步骤^伊巴拉．从图片Zhu et al.， 2019．

分析师Wensheng魏的实验室北京大学的研究人员开发了一种新的CRISPR筛选方法，利用在其环区带有内部条形码(iBARs)的引导rna。用sgRNA感染细胞后^伊巴拉iBARs可以通过下一代测序检测到。188完整比分直播

为了避免高假阳性率的发现率，传统的CRISPR筛选在构建细胞库时需要较低的感染多重性(multiplicity of infection, MOI)，以确保大多数细胞接收到一个gRNA。即使在感染的多重性很高的情况下，iBAR方法也能获得高质量的数据，因为这种设置允许对每个grna进行实验复制。这个想法是给每个gRNA分配四种不同的条形码，并将这些条形码嵌入gRNA序列中。这使得在同一实验中，通过计数gRNA及其iBAR序列，可以多次跟踪每个gRNA的表现。自从sgRNA^伊巴拉文库覆盖了每一个注释的人类基因，它能够以高MOI的全基因组筛查，这有利于低数量的细胞和在体内设置。

找到sgRNA^伊巴拉图书馆!

Zhu et al.， Genome Biology, 2019。PubMedPMID: 30678704．

利用重组酶竞争的细胞稀疏标记

文章提供的读经文温斯坦

通过重组酶竞争的稀疏预测活性(SPARC)是一种完全的遗传工具，用于标记遗传定义的细胞子集的一小部分。通过标记群体中更少的细胞，更容易看到单个/非重叠的细胞。到目前为止，完成这项工作的工具是劳动密集型的，需要使用诸如注射AAV的精确滴定液或对生物体进行热休克等操作。

SPARC系统使用竞争性重组位点选择性地移除效应/报告基因上游的停止盒。在停止盒被移除的细胞中，效应体被表达出来。通过将结构中的一个重组位点截短到不同长度，被标记的细胞密度可以改变为密集(45%的细胞标记)，中间(12%)和稀疏(4%)水平。

SPARC是一个多功能系统，可以用于许多细胞类型和生物体，包括果蝇，鱼和老鼠，通过替换效应器与你正在研究的细胞感兴趣的基因。阅读我们的SPARC博客为更多的细节。

图2:在果蝇的视叶中，钙指示剂GCaMP6f的密集(c)、中间(d)和稀疏(e)标记。从图片艾萨克曼-贝克等人，2019年．

从稀疏标签开始

Isaacman-Beck等人，bioRxiv 2019。https://doi.org/10.1101/788679

酵母中钙调磷酸酶活性的不稳定GFP报告

文章提供的利亚Schwiesow

钙调磷酸酶是一种蛋白磷酸酶，可对细胞内钙水平的上升作出反应。当钙的水平^２＋钙调磷酸酶使CZI蛋白去磷酸化，而CZI蛋白又与钙调磷酸酶依赖的反应元件(CDREs)结合并驱动基因表达。由于钙调磷酸酶是致病真菌致病所必需的，因此它是一个有吸引力的药物靶点。钙调磷酸酶报告允许科学家测量钙调磷酸酶动态，并可以作为一个药物筛选平台，以确定新的抗真菌靶向钙调磷酸酶。

目前钙调磷酸酶基因报告是基于细菌βgal测定，不适合高通量筛选、钙调磷酸酶动态测量或监测在活的有机体内．为了克服这些技术问题，塞布丽娜Buttner的实验室设计了一种钙调磷酸酶转录报告基因，由快速降解的不稳定GFP变体融合到4X cre重复序列。除了表明该载体适用于流式细胞术和荧光显微镜，他们还表明该方法与使用丙酸碘(PI)的死细胞染色兼容，允许在应激或衰老细胞群体中测量钙调磷酸酶活性。

Calcineurin-reporter

图3:野生型(上图)和细胞内Ca2+含量高的细胞(下图)的显微照片，细胞内有不稳定的GFP钙调磷酸酶报告(蓝色)，PI染色(粉色)表明细胞死亡。从图片Diessl等人，2020年．

找到GFP报告钙调磷酸酶活性

《微生物细胞》，2020。https://dx.doi.org/10.15698%2Fmic2020.04.713

截短的tale荧光蛋白融合作为DNA染色染料

文章提供的詹妮弗曾

图4:tTALE-FP结合的双链DNA与荧光蛋白呈绿色荧光。从图片Shin et al.， 2019．

寻找一种替代插入荧光染料用于dna -蛋白质相互作用研究的方法?Kyubong乔的实验室与tTALE产生荧光蛋白融合以“染色”DNA。TALE蛋白可以结合特定的DNA序列，将荧光蛋白附着到DNA上。他们创造了用于纯化tTALE-eGFP和tTALE-mCherry的质粒。

与可引起光诱导DNA断裂和结构变形的插层荧光染料相比，这些探针是可逆的，不会引起结构变形或光诱导损伤。这些熔体也可以在高盐条件下发挥作用-高达100mm的NaCl。这些tTALE-FPs对40 mM至100 mM NaCl中富含at的区域与富含gc的区域也有更高的DNA结合亲和力，但在1倍TE缓冲液中染色均匀。实验室还在单分子荧光分析中使用了tTALE-FP来实时监测单分子的限制性内切酶消化。

寻找表达tTALE-FP的质粒

申等人，Sci。众议员2019。https://doi.org/10.1038/s41598-019-53722-0