薄层荧光显微术

本文由李杰从前和Pantelis Tsoulfas他是迈阿密大学神经外科的主任。

本世纪初，光学显微镜取得了一些重大进展，特别是在神经科学方面。显微技术的发展与使组织透明的技术相结合，使显微镜能够以前所未有的细节在3D中可视化整个组织的细胞结构。这些显微镜的进步之一是薄层荧光显微镜(LSFM)。1902年，Richard Zsigmondy和Henry Siedentopf发明了这种方法，以提高研究胶体金的显微镜分辨率(1)。这种方法是基于用阳光产生的薄平面(片)光来观察直径小于4nm的单个金颗粒。

清除的大鼠脑桥、髓质和脊髓第一节的侧视图，显示皮质脊髓束、CST、脊髓和脑神经输入区，在人泛素C启动子下标记有表达eGFP的AAV8。解剖缩写:Gr= Gracile束，Cu= Cuneate束，dCST=背侧皮质束，vCST=腹侧皮质束，dc= CST交叉，pd=锥体束，pt=锥体束或CST穿过脑桥和延髓，bp=基底脑桥，NST孤束核。箭头指向标本的方向，A=前，P=后，D=背，V=腹

光片荧光显微镜的发展

现代光板荧光显微镜是由Voie和他的同事最先提出的，最初命名为正交平面荧光光学切片(OPFOS)(2)。大卫·伯恩斯和弗朗西斯·斯佩尔曼将激光束聚焦成薄片，照亮荧光样品，并使用垂直于照明平面的不同物镜(即光片)捕捉反射光。这与激光共聚焦显微镜相反，激光和反射光通过相同的物镜。使用这种方法，这些作者能够在三维重建清除豚鼠耳蜗。这次重建中使用的仪器的基本配置为以后所有版本的LSFM显微镜奠定了基础(3,4)。

在最初的应用之后，Stelzer的小组描述了单面或选择性平面照明显微镜(SPIM)。为了提高活体标本的轴向分辨率和减少光毒性，他们将光板显微镜与顺序多视图重建相结合(5)超显微镜是使用立体显微镜来捕获大视场的(6)。关于其他几种LSFM配置的各种特性的更全面的评论，请参见(4,7)。

光片荧光显微镜与共聚焦显微镜

在共焦显微镜，样品的光学切片是利用针孔识别出离焦的反射光。然而，激发光激发了所有的荧光团当它穿过标本时，通常会导致光漂白。此外，沿着整个标本逐点扫描，对于厚度为毫米(8,9)的大标本来说，成像太慢且难以处理。此外，由于光的散射和吸收，图像亮度随深度的增加而下降。最后，在共聚焦显微镜中用于探测光的光电倍增管的效率比在LSFM中使用的现代相机要低。

在LSFM中，激光光片，通常2-6微米，只照亮样品的一个薄薄的平面，围绕着检测透镜的焦平面，因此没有离焦的光。因此，与传统的激光扫描显微镜相比，光漂白或光损伤要少得多。由于图像采集是使用带有电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器的相机进行的，因此获取一张图像只需要几毫秒，因此大大减少了通过大z-堆栈成像所需的时间(8)。使用单面照明的LSFMs的一个限制是，任何障碍(例如气泡或高浓度的荧光团)都会沿着照明路径投下阴影，尤其是在大组织中。在获取的图像中，阴影以条纹的形式出现(5)。解决这个问题的一种方法是照亮并从样品的相对两侧获取图像，并合并图像，例如在超微显微镜中。此外，调整激光薄片的厚度和使用多视图成像可以提供更高的分辨率(8,9)。因此，LSFM是清晰标本的三维重建和透明生物体的活体成像的理想选择。

组织清理的研究进展

与光学显微镜相似，本世纪组织清除技术也取得了重大进展。Walter Spalteholtz(10)首次成功尝试使固定解剖标本透明。他使用了一种由苯甲醇和水杨酸甲酯组成的溶液，这种溶液后来被其他人修改成Murray的透明溶液。Murray's clear(11)主要用于研究脊椎动物胚胎的发育。第一个透明胚胎的3D重建是通过光学投影断层扫描(OPT)获得的(12)，后来Hans-Ulrich Dodt的实验室率先使用光板显微镜对透明的整个安装标本，如整个小鼠大脑表达绿色荧光蛋白(6)．

Dodt和Frank Bradke实验室后来发展了3DISCO(溶剂清除器官的三维成像)方法，通过将超微与四氢呋喃组织清除相结合来成像啮齿类动物的大脑和脊髓(13,14)。几年后，Karl Deisseroth的实验室开发了CLARITY，这是一种基于水凝胶的方法，也允许抗体穿透整个组织进行免疫组化标记(15)。CLARITY也与LSFM兼容，这种方法被称为COLM(清晰度优化光板显微镜)(16)。3DISCO和CLARITY都依赖于转基因小鼠，其中一个神经元亚群被GFP明亮地标记(例如Thy1-YFP-H小鼠)。然而，我们最近发展了AAV(腺相关病毒)基于荧光标记的方法，可用于3DISCO成像非转基因动物，如大鼠(17)。此外，与转基因动物相比，使用病毒可以更好地控制标记方法的时空(17)。这些病毒质粒可以通过Addgene。将LSFM与多种组织清除策略和神经元标记方法相结合，将极大地帮助我们理解正常和疾病状态下中枢神经系统的结构-功能关系。

感谢我们的客座博主Jae Lee和Pantelis Tsoulfas。

Jae K. Lee是迈阿密大学米勒医学院的助理教授。找到李实验室的质粒在这里．

Pantelis Tsoulfas是迈阿密大学米勒医学院的副教授。找到Tsoulfas实验室的质粒在这里．

引用:

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