小鼠建模，第1部分：基因工程小鼠

自交系和远交系

用于研究的小鼠品种可以分为两大类:近亲繁殖或非近亲繁殖。近交系具有共同的遗传背景，这意味着每只小鼠的基因是相同的，并且该菌株的所有小鼠几乎在所有位点都是纯合子的。这减少了基因型和表型的可变性，并有助于提高实验的可重复性。近交系小鼠对于理解与实验操作相关的特定效果特别有用。常见的近交系有C57BL/6、Balb/c、129。

相反，非亲缘系最初是由无特征背景的小鼠之间的随机杂交得来的，以创建一个有限但基因多样化的基因库。远缘品系是为了在种群中保持最大的遗传杂合度而进行的战略性繁殖，这意味着它们更接近于人类种群的遗传多样性。远系小鼠可用于比较显性和隐性性状及其对疾病或治疗的影响，但不适用于基因工程。远系菌株的例子包括瑞士韦伯斯特和哈兰(Hsd)国家卫生研究院(NIH)瑞士。

转基因小鼠

通过将含有感兴趣基因的靶向载体插入受精卵或胚胎干细胞中，然后将其注射到囊胚中，可以改造老鼠。基因工程小鼠有几种类型:转基因小鼠、敲除小鼠和有条件或诱导基因表达的小鼠。

转基因和基因敲入小鼠

顾名思义，转基因小鼠和敲除小鼠的基因组中还含有一个额外的基因。转基因小鼠将新的基因结构随机纳入基因组，而敲除小鼠将基因结构插入特定位点。

为了制造转基因小鼠，DNA的微注射或病毒载体的感染含有该基因结构可以用来将感兴趣的基因插入受精卵或胚胎干细胞中。非同源重组将这种DNA随机地合并到小鼠基因组中。相反，敲入菌株是通过同源重组产生的。一个靶向载体被电穿孔到胚胎干细胞中，这将使用同源臂将基因插入到基因组的特定位置，该同源臂位于感兴趣的基因的侧面。在这两种情况下，一个积极的选择标记，如抗生素抗性基因也被包括在内，以选择成功修饰的受精卵或胚胎干细胞。将改良的胚胎干细胞注入囊胚，然后将囊胚植入雌性动物进行妊娠。

诱导双链DNA断裂的核酸酶，例如ZFN和取得，可用于基因敲除小鼠。将含有同源末端的靶向载体共注射到断点可促进靶向载体的同源重组。CRISPR/Cas9-已经开发出基于基因敲除的系统来产生敲除小鼠，但是因为CRISPR/Cas9工程有利于通过非同源末端连接进行DNA修复，新插入的基因可能在DNA修复过程中引入核苷酸序列错误。加入小分子以促进同源重组或重组长单链DNA的应用提高了同源重组的效率，从而实现了精确的基因插入。然而，CRISPR/Cas9系统对产生敲除小鼠更有用。

基因敲除小鼠

基因敲除老鼠经历了基因改造，改变或消除了特定基因的表达。用来制造敲除小鼠的靶向载体包括一个报告基因，它取代了目标基因，并提供了一种跟踪成功工程细胞的方法。与转基因小鼠相似，基因敲除小鼠在胚胎干细胞阶段使用几种技术中的一种进行基因工程。持续时间最长的技术是将靶向载体注入胚胎干细胞，然后将其注入囊胚。

核酸酶也可以用于基因敲除小鼠。ZFN、取得和CRISPR / Cas9系统都可以靶向基因组的特定区域，并在DNA损伤部位诱导非同源修复。这些核酸酶被微注射到受精卵中，然后植入雌性小鼠进行妊娠。这三种基因都可以引入多个碱基对缺失，但CRISPR/Cas9也可以引入点突变。

虽然使用靶向核酸酶生成工程小鼠模型比单独注射靶向载体具有优势，但仍存在一些挑战。核酸酶可能对基因组中与感兴趣的部位具有类似同源性的区域产生非靶向效应，或产生镶嵌动物，其中并非通过注射胚胎干细胞成功编辑囊胚中的所有细胞。此外，由于非同源修复是一个随机过程，使用同一核酸酶编辑的合子可能不会产生基因完全相同的小鼠。因此，科学家必须对每只动物进行基因分型，以确定具有所需基因型的动物。

诱导系统和条件系统

条件敲除或敲除

转基因小鼠的一个子集，条件敲除/敲入小鼠，使用Cre-lox重组系统在特定细胞或特定刺激下表达转基因。Cre重组酶催化位于两个loxP位点之间的DNA序列重组。loxP位点存在于靶向载体中基因的两端，形成了絮状基因片段。将含有FLOX基因的小鼠与表达Cre的菌株杂交（将在本博客系列第2部分中详细介绍）控制细胞类型，其中条件重组可以基于表达Cre的细胞发生。

这种技术的几种变体可用于自定义这种重组的效果。为了产生条件敲除小鼠，将loxP位点直接插入到基因组中，位于将在cre介导的重组后被删除的基因的侧面。在条件敲入小鼠中，靶基因最初被靶基因上游的停止盒抑制。停止盒是卷曲的，因此cre介导的重组删除停止盒，从而允许靶基因的表达。此外，creo -lox系统可以用来逆转DNA片段或将DNA片段从基因组的一个区域转移到另一个区域。

诱导基因表达

另一种基因工程小鼠模型允许通过调节Cre表达的药物或小分子来控制基因表达。诱导Cre表达最常用的药物是他莫昔芬。在三苯氧胺诱导的Cre (cree - er)系统中，Cre融合到雌激素受体的配体结合域(Esr1)。给小鼠喂食或注射三苯氧胺，它可以缓解抑制Cre表达的Esr1结构域的自然抑制。然后，Cre在细胞中表达，并可发生Cre介导的絮凝位点重组。类似的系统包括四环素或多西环素介导的Cre激活，使用TetON或TetOFF系统诱导或抑制Cre表达。

因此，现在希望创造一个基因工程小鼠似乎不那么令人沮丧！在本系列的第二篇博文中，我将讨论跨越和保持老鼠紧张。

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