高通量克隆，简而言之，是将不同的基因序列系统地组合成质粒DNA。在高通量克隆技术中，虽然基因元件的特定序列可能不同（例如，一组不同的哺乳动物启动子），但相同克隆的过程可用于将每个元素合并到最终构造中。该策略可用于构建具有多种功能的载体，因此在许多生物学领域都有应用。在里面合成生物学例如，高通量克隆可用于组合不同遗传元素的功能，以生成新的生物电路或传感器等非自然工具。鉴于荧光蛋白种类的扩大和强大的成像技术的可用性，结合多个荧光蛋金宝搏app下载白序列来开发不同的荧光报告是高通量克隆的一个有用应用。MXS链接是这样一种技术，并已用于生产复杂的荧光报告结构。这些荧光报告可用于检测结构和蛋白质定位，以及基因表达和细胞迁移等细胞过程(Sladitschek和Neveu, 2015年)．
MXS链接的起源和目的
mxs链的目的是创建质粒，用于在哺乳动物细胞中的荧光成像或流式细胞术应用。该方法中使用的模块包括荧光蛋白、启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、诱导基因表达序列金宝搏app下载等。通过组合这些组件，可以生成结构可视化细胞周期动态，滴定诱导转基因表达，或各种其他聪明的应用。
在一个例子中，使用MXS链生成的模块化结构来标记活细胞中的亚细胞结构。创建了四个单独的表达结构，每个结构都包含一个独特的荧光蛋白，它们之间的光谱重叠最小（表1）。在每个结构中，荧光蛋白的3个拷贝在框架中融合到一个系链伙伴，该系链伙伴指导荧光团的定位，从而能够标记特定结构（表1）。每个构建体两侧都有一个CMV启动子（用于驱动高水平表达）和一个polyA信号（用于终止转录），然后将这四个构建体结合起来，形成一个15 kb的多顺反子插入体。最后的构造随后被引入到HeLa细胞（图1）。由此产生的HeLa细胞显示出强大的标记，在各自的亚细胞结构上具有每个荧光团的强表达和检测（图1）。在这里，MXS链接使研究人员能够生成四个最初的独特结构，然后将所有四个结构组合成一个15KB的插入。
表1：用于标记细胞结构的MXS构造
| 建筑 | 荧光团 | 激发/发射最大值 | 拘束的伴侣 | 亚细胞定位 |
| 1. | TagBFP | 399nm/456nm | 组蛋白2B（H2B） | 染色质 |
| 2. | 天蓝色的 | 433nm/475nm | Lyn标签（源自酪氨酸蛋白激酶Lyn） | 膜 |
| 3. | 麦克赫里 | 587nm/610 nm | 人β-肌动蛋白 | 肌动蛋白 |
| 4. | 柠檬酸 | 516海里/ 529海里 | 人类α微管蛋白 | 微管蛋白 |
可重复的定向克隆
MXS连锁背后的原理是可重复的、基于限制性内切酶（基于连锁）的克隆。模块（图2）包含在单个质粒中，每个模块的两侧都有相同的多克隆位点（MCS）。模块按照标准一次组装一个限制性内切酶消化后连接．结扎后，每个结扎产物的侧翼都能再生MCS的原始形态，这是该方法可重复性的基础。需要注意的是，MCS的限制位点仅在连接产物的5 '和3 '端再生，模块之间的限制位点在连接时被消除。因此，一旦两个模块相邻组装，第三个模块就不能放在它们之间，而只能使用新生成的MCS添加到5 '或3 '端。mxs链还具有方向性的优点，这意味着(在前面的例子中)可以控制是否将第三个模块添加到连接产物的5 '端或3 '端。
与其他高通量克隆策略的比较
有几种高通量克隆策略可用于组装这些模块化结构类型，不同的方法适用于特定的下游应用。表2中列出了各种克隆方法之间的权衡。例如，基于链的克隆方法要求使用这些技术组合的单独模块没有特定的限制性内切酶识别位点。因此，链式方法不一定适合组合内源性序列。
表2：高通量克隆策略
| 方法 | 技术 | 优点 | 缺点 | 工具书类 |
| 金门 | II型限制性内切酶 | 一步最多可组装10个模块。通过此步骤的迭代，最终构造可以包含无限数量的模块。 | 模块顺序的约束，因为相邻片段需要兼容的内聚端 | Engler等人，2008年 |
| 吉布森克隆 | 吉布森装配法 | 单一反应，可以组装大的DNA序列，不需要限制性内切酶 | 不适合连接具有高度一致性的序列，因此不适合生成包含多个相同聚腺苷酸化信号或启动子的多顺反子 | 吉布森等人，2009年 |
| MXS链接,生物积木,Bglbricks等等。 | 基于链的方法（基于限制性内切酶）。 | 非常适合高度相似或重复序列的模块化组装。中间链产品（称为“盒式磁带”）可在任何后续结构的组装中轻易重复使用（即，功能盒式磁带可回收） | 只有当用于组装的限制位点在模块本身内未找到时（因此可能不适合内源性编码序列），酶的选择才起作用。可能不支持编码序列的帧内融合 |
Sladitschek和Neveu, 2015年;Shetty等人，2008年;安德森等人，2010年 |
在基于链的方法中，所使用的特定限制性内切酶影响可以组装的一般类型的模块。例如,因为CpG二核苷酸的大多数脊椎动物基因组(Josse et al ., 1961年,斯沃茨et al ., 1962),萨利·,XhoI和MluI识别网站,其中包含CpG个六的二核苷酸序列,很少发现这些物种的转录组,通常可以用来克隆的互补。然而，这些酶可能不适合于从CpG二核苷酸表现较高的生物体中克隆基因。各种链基克隆方法所使用的限制性内切酶如表3所示。
高通量克隆的目的是方便构建具有多种成分的质粒。mxs -chain方法的创建者已经使用该技术在哺乳动物细胞培养系统的流式细胞术方法中应用了各种结构(他们最初的目的)。他们的工作证明了mxs -链接方法可以用于健壮、快速和简单地构建这些类型的结构。我们希望您可以将mx链接应用于您的实验需求。让我们知道你如何使用mx链接通过电子邮件给我们blog@addgene.org．
表3:基于链接的克隆方法
| 方法 | 限制酶 | |
| 链接 | 方向 | |
| MXS链接 | 萨利·和XhoI | MluI |
| 生物积木 | SpeI和XbaI | EcoRI和PstI |
| Bglbricks | BglII和BamHI | 限制酶 |
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工具书类
1.Anderson JC、Dueber JE、Leguia M、Wu GC、Goler JA、Arkin AP等。BglBricks：生物部件组装的灵活标准。生物工程杂志。2010;4(1):1.PubmedPMID: 20205762. 公共医学中心PMCID:pmc282740．
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3.吉布森DG，杨L，庄瑞，文特尔JC，和记黄埔，何史密斯。高达数百千碱基的DNA分子的酶组装。自然方法。2009也许6(5):343–345.PubmedPMID:19363495．
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