纳米叶片:基因组编辑困难细胞的微小CRISPR忍者

CRISPR是基因组工程中一种简单而多功能的工具，但其效用取决于其渗透细胞的能力。选项CRISPR传递包括质粒转染，RNP电穿孔，病毒转导;但这些方法还不够隐秘，无法获取某些细胞和组织，比如人类诱导多能干细胞(hiPSCs)。纳米片是一种新的CRISPR传递方法里奇实验室和t . Ohlmann实验室，在CRISPR工具框中增加隐蔽工具。

纳米片是由装载Cas9-gRNA核糖核酸蛋白(RNPs)的小鼠白血病病毒(MLV)样颗粒改造而成。根据作者的说法，他们将他们的工具命名为纳米刀片，因为他们认为这些粒子是微小的DNA切割忍者，可以将CRISPR传递到多种类型的目标:初级细胞、胚胎和动物。纳米片还可以携带不同类型的CRISPR货物，包括rnp通过NHEJ形成indel，同源定向修复(HDR)的精确修饰, CRISPR激活或镇压，转基因小鼠系创造,在活的有机体内小鼠的基因编辑，并有可能用于其他类型的CRISPR应用。让我们来看看nanobades的关键组件，与现有技术相比，它们的编辑效率和脱靶效果如何，以及它们在HDR编辑和鼠标模型生成方面的用途。

纳米叶片的关键部件

Nanoblades是一个Cas9 RNP基于小鼠白血病病毒(MLV)病毒样颗粒(VLPs)的运载工具。VLPs缺乏病毒基因组，这意味着它们是非传染性和非复制性的。纳米片是通过将以下四种成分转染到293T细胞中产生的。

MLV gag pol多蛋白

当病毒结构蛋白(如MLV蛋白Gag)在细胞膜上多聚并自发组装成粒子时，纳米叶片就形成了。成熟的纳米叶片接芽入细胞培养上清，可离心纯化。

Gag-Cas9融合蛋白

MLV Gag蛋白融合到一个Flag-tagged SpCas9被纳入纳米刀片，就像未修改的MLV Gag蛋白。加入Gag-Cas9后，MLV蛋白酶作为MLV Gag-Pol多聚蛋白的一部分，切割连接两个蛋白的蛋白水解位点，从而释放Cas9。纳米刀片还可以提供Cas9的变种，例如转录激活dCas9-VPR，如果这些变体被融合到MLV Gag代替SpCas9。

gRNA

一种针对感兴趣的DNA序列的gRNA在293T细胞中表达，并通过与Gag-Cas9融合蛋白的Cas9部分结合而装载到纳米片中。单个纳米刀片粒子可以装载1-4种不同的grna。

病毒囊膜蛋白

为了改变纳米片的细胞取向，不同的病毒包膜蛋白被表达pseudotypeNanoblades。研究小组发现，纳米刀片的假型混合了VSV-G和狒狒内源性逆转录病毒糖蛋白他们测试的大多数细胞类型都有很高的转导率。

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用纳米叶片编辑初级细胞的基因组

原代细胞通常难以通过基因传递的方法，但研究人员能够使用纳米刀片编辑hiPSCs、小鼠骨髓(BM)细胞、原代人肝细胞和造血干细胞(HSCs)。总的来说，这四种细胞类型的编辑效率在~50-70%之间(表1)。此外，hiPSCs和小鼠BM细胞在纳米刀片处理后仍然表现出与iPSCs和BM细胞相似的行为，分别通过多能性标记物表达的维持和对LPS刺激的响应来测量。

表1：纳米片编辑原代细胞的效率。

纳米薄片与现有CRISPR传递方法的比较

与现有的CRISPR传递技术相比，纳米刀片具有更高的编辑效率和更低的脱靶效应。当使用gRNA靶向小鼠骨髓细胞时，纳米刀片产生高达76%的编辑效率Fto基因，而在用RNPs电穿孔的细胞中未检测到编辑。与DNA转染gRNA和Cas9表达质粒相比，纳米片的脱靶效应也较低。这些结果与之前的研究一致，Cas9和gRNA传递的方法可以影响脱靶效应的水平，与与DNA转染相比，rnp的电穿孔通常具有较低的脱靶编辑．

纳米片的同源定向修复(HDR)

CRISPR-basedHDR允许精确插入DNA序列，范围从单个核苷酸的变化到大的插入，如添加荧光团或标签。为了利用HDR，必须通过同源臂将包含所需序列侧面的供体模板与gRNA和Cas9一起递送到细胞中。通过将纳米刀片粒子与阳离子聚合物聚苯乙烯(polybrene)一起孵育，可以生成带有gRNA、Cas9和HDR供体模板DNA的“一体化”纳米刀片。聚苯乙烯长期以来被用来通过中和病毒粒子和细胞表面之间的电荷排斥来提高逆转录病毒转导的效率也有助于形成DNA和逆转录病毒粒子或VLPs复合物。研究小组发现，“一体化”的纳米刀片可以通过ssDNA或dsDNA供体模板促进HDR。

在活的有机体内用纳米叶片编辑小鼠受精卵和小鼠

CRISPR也被广泛用于培育转基因小鼠微注射带有CRISPR成分的受精卵．然而，这有时需要将细胞内注射到受精卵的细胞质或原核中，这既具有技术挑战性，也会对受精卵的活力产生负面影响。然而，纳米叶片可以避免这个陷阱，因为它们被注入受精卵周围的空间，在那里它们可以与目标细胞膜融合，并将CRISPR载体转移到受精卵中。作为原理证明，该团队使用纳米刀片破坏小鼠受子中的酪氨酸酶(Tyr)基因，从而导致小鼠白化病。出生的八只老鼠中酪氨酸纳米叶片处理的受精卵中，5个可检测到酪氨酸在表型和基因型水平进行编辑。嵌合和完全白化小鼠的编辑效率从11%到100%不等，类似于其他方法的水平．

纳米片还可以用于对成年小鼠的肝脏进行非侵入性基因编辑。当小鼠IV注射靶向羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPD)基因的纳米刀片时，所有9个处理小鼠的肝脏都有~10%的编辑，而未注射和对照组gRNA注射小鼠没有可检测到的编辑。此外，未检测到脾脏脱靶编辑，Nanoblade注射没有引起发病率。这些结果表明，纳米叶片是一种潜在的替代方法，以产生转基因小鼠株和非侵入性在活的有机体内基因编辑。

纳米刀片的底线

纳米叶片是微小的dna切割忍者，可以偷偷地将许多类型的CRISPR编辑货物运送到难以瞄准的细胞。与现有的Cas9交付方法相比，纳米刀片具有同样好的(如果不是更好的)靶上编辑效率，而较低的脱靶编辑。纳米棒的另一个优点是什么?它们很容易在BSL2实验室中产生，使它们成为一种通用且易于使用的基因组编辑工具。

参考文献

Mangeot, Philippe E.等。“使用装载Cas9-sgRNA核糖核蛋白的病毒源纳米刀片在原代细胞和体内进行基因组编辑。”自然通讯10.1(2019): 45。PubMedPMID: 30604748．公共医学中心PMCID: PMC 6318322．

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