中枢神经系统（CNS）协调复杂的过程，使生物体能够控制它们的运动和行为。这些功能和其他功能由神经元集合控制，这些神经元通过突触连接错综复杂地连接到电路中(谢泼德，2004年).了解这些神经回路的结构和功能对神经科学研究至关重要。最近，利用遗传工具可视化和干扰电路，以及将基因传递到中枢神经系统的方法学的发展，使得绘制这些神经网络图变得更加容易。
近三十年来，重组腺相关病毒（AAV）由于其低细胞毒性、低免疫原性和AAV传递基因的长期表达，已被广泛用于向大脑传递基因工具。AAV血清型已被广泛研究，以确定那些针对大脑中特定神经元群体的血清型。这个艾伦学院和珍妮莉亚研究院在美国，科学家已经使用AAV1和AAV2血清型来创建小鼠大脑图谱。该图谱使研究人员能够快速找到最佳AAV血清型，以针对他们正在研究的神经元。多亏了这项工作，现在在你最喜欢的神经元群体中表达分子和追踪与该群体的联系变得容易多了。
常见基因编码神经元示踪剂的局限性
神经元示踪剂，如表位标签和金宝搏app下载荧光蛋白（FP）在绘制、监测和操纵神经回路方面也很重要。表位标签是短的抗原肽序列，附着在感兴趣的蛋白质（POI）上，有助于用标签特异性抗体进行免疫组织化学（IHC）实验。最著名的是流感血凝素（HA）、骨髓细胞瘤病病毒癌基因（myc）、猿猴病毒5衍生表位（V5）、合成肽标记、合成链霉亲和素结合链球菌标记，以及最近的OLLAS(大肠杆菌OmpF链接器和鼠标（langerin）和Sun标记(维斯瓦纳坦，2015年).
IHC表位标签的主要优点是可用于检测的可靠一级抗体，特别是当POI抗体非特异性、与其他抗体交叉反应或完全不可用时。另一个优点是这些标签很小（8-12个氨基酸）并且既不会干扰POI折叠，也不会干扰其与细胞内蛋白质伙伴相互作用的能力。然而，抗体对这些标签的亲和力可能较低，甚至当POI弱表达时，多聚体标签通常也不足以检测。由于这些表位标签没有固有的视觉信号，因此无法在细胞内直接检测到活体成像实验。因此，很难使用表位标签来监测单个分子——例如，研究人员经常想在神经元突触上做这件事。此外，这些标签需要与支架蛋白融合，以便在神经元中稳定表达。
与表位标签相比，FPs本质上是荧光的，因此可用于对研究神经元回路和动力学至关重要的活体成像实验。FPs通常明亮、稳定且细胞耐受性良好。它们可用于蛋白质定位、分离和跟踪实验(里佐，2009)通过在可见光谱中发射许多不同的FPs，研究人员还可以在单个实验中使用多个FPs，同时可视化多个分子或结构(谢纳，2007)与表位标签相比，FPs更大，它们与POI的融合会影响蛋白质折叠和蛋白质-蛋白质相互作用。此外，FPs的过度表达可触发对细胞有毒的蛋白质聚集，并影响小结构（如神经轴突）的标记。与表位标签一样，低FP表达可能不足以监测弱表达的POI。
意大利面怪物-一种新的和改进的神经元示踪剂
由于表位标签和荧光蛋白的局限性，开发能够准确标记神经元的新示踪剂至关重要。如上所述金宝搏app下载，弱表达蛋白质尤其难以用这些经典探针追踪。为了克服现有FP和表位标签的局限性，研究人员洛伦·洛格实验室已开发出结合两者优点的新分子标签（Viswanathan，2015）。对于Looger的团队来说，理想的探针应该结合FPs的溶解性、细胞耐受性和选择性荧光以及表位标签的简易抗体识别。因此，他们创造了一种称为“意大利面怪物”荧光蛋白（smFPs）金宝搏app下载. smFPs实际上由融合到多个表位标签的FPs组成。事实上，创建smFPsLooger的团队策略性地将10到15份单表位标签插入到具有完整或深色发色团的单FP支架中。这些探针都是固有荧光探针，并且可以用高度表位特异性的荧光标记抗体检测。
“意大利面怪兽”的名字是指社会运动的神，即飞行的意大利面怪兽教堂；smFP结构类似于神的图像（参见上面的对比图像）。飞行的意大利面怪物教堂是一个反对在公立学校教授智能设计的象征，由俄勒冈州州立大学物理学毕业生鲍比·亨德森于2005年在堪萨斯州创立。
smFPs的用途
1.多通道连接组示踪剂
金宝搏app下载荧光蛋白（如GFP）长期以来一直被用作研究连接组学（神经回路如何组织以及神经元如何相互连接）的探针。与AAV相结合，FPs可以很容易在大脑中表达，并可以通过其直接荧光信号或使用抗FP抗体进行检测。
GFP仅在单个通道中发光。在多色成像实验中，第二种颜色通常由红色荧光蛋白（如TD番茄或RFP）或蓝色荧光蛋白（如青色）提供。这些FPs的问题在于，它们比GFP更难拍照。此外，基于抗体的信号放大较弱，增加了背景荧光。此外，许多FPs具有细胞毒性，金宝搏app下载易于聚集并与抗GFP抗体发生交叉反应，因此难以在多色/多通道成像装置中使用。相比之下，smFP标签可以被不同的荧光标记抗体识别，这些抗体具有非常特异的反应性，使得它们比标准FPs更适用于多色成像实验。因此，Looger实验室能够轻松地使用SMFP和标准神经元示踪剂进行四色标记实验。
2.神经元亚细胞结构的可视化
GFP标记中枢神经系统亚细胞结构的能力有限。GFP和其他FPs倾向于明亮地标记躯体，但不标记神经元过程。相比之下，smFPs可以高保真地标记精细神经元结构，且浓度比GFP低。smFPs通过其多个e、 初级抗体的高亲和力结合位点，可用于放大亚细胞结构内的直接smFP信号。例如，smFP已被用于可视化“刺状赘生物”（TE）海马CA3区锥体神经元中的棘突，众所周知很难标记。研究还表明，海马CA3区锥体神经元中的树突地层定向和分子陷窝层解决得更好使用smFP_标志而不是GFP。
3.增强区分弱表达和/或类似蛋白质的能力
通过其多个高度特异性的抗体结合位点和基于一级抗体的检测，smFPs为弱表达的蛋白质产生比标准标签更明亮的信号，并可用于区分高度相似的蛋白质。例如，N-钙粘蛋白（cadherin-2）是一种突触后细胞粘附蛋白，在神经发育中起着关键作用。它属于一个庞大的蛋白质家族，在序列上高度相似，因此使用标准抗体很难区分。通过将N-钙粘蛋白融合到smFPs，Looger团队能够在神经元中特异性标记N-钙粘蛋白，并表明smFPs融合比融合到3个或更多HA标签提供更好的标记。
4.高分辨率显微镜
如上所述，smFPs可用于常规显微镜，如荧光显微镜或共焦显微镜，但也可用于最前沿的成像技术，如阵列层析成像、超分辨率风暴成像和电子显微镜。这些技术的样品制备有时使使用抗体检测蛋白质标签更加困难。相比之下，SMFP具有许多表位，在样品制备后比GFP等标准蛋白质标签更好地保留其检测能力。特别是对于风暴，smFPs提供的高强度信号可以产生更好的分辨率图像。
结论
通过结合FPs和表位标签的优点，smFPs似乎是精细显示亚细胞结构或低丰度蛋白质的非常有效的探针。当与AAV一起交付时，这些探针可用于标记通常难以看到的神经元回路和结构。smFPs是神经科学家研究大脑的工具包的一个极好的附加组件，我们期待着smFPs在未来的扩展使用。
工具书类
1.光和电子显微镜用高性能探针自然方法12.6 (2015): 568. PubMedPMID:25915120公共医疗中心PMCID:PMC4573404.
2.Shepherd，G.M.（2004年），“中”大脑的突触组织“.牛津大学出版社，纽约，第719页。
3.荧光蛋白追踪和检测：荧光蛋白结构和颜色变体冷泉港协议2009.12（2009）：pdb-top63. PubMedPMID:20150100.
4.肖纳，内森C.，乔治H.帕特森和迈克尔W.戴维森，“荧光蛋白技术的进展。”细胞科学杂志120.24 (2007): 4247-4260. PubMedPMID:18057027.
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