最初发布于2014年2月6日，最后更新于2020年11月10日。
现在我们都知道了抗生素抗性基因，让我们考虑另一个任何质粒的基本成分:复制/复制的起源。复制子由复制的起源(让奥)及其所有控制元素。的让奥是DNA复制开始的地方，使质粒能够复制自己，就像它必须在细胞中生存一样。
质粒的复制子通常不同于用于复制宿主染色体DNA的复制子，但它们仍然依赖宿主的机制来进行额外的复制。让奥序列中a和t的含量通常很高，你会问为什么?A-T碱基对由两个氢键连在一起而不是像G-C碱基对那样是三个氢键。因此，富含a - t对的DNA片段可以在较低的温度下更容易分离，从而允许复制机器进入并忙于复制。
复制起源的类型
复制的起源有很多，为了简单起见，我们忽略了真核细胞和病毒中的复制起源而只关注细菌中的复制起源。常见的有ColE1, pMB1(有一些稍微不同但众所周知的衍生物)，pSC101, R6K和15A。并非所有复制的起源都是一样的。有些会产生许多质粒副本，有些则只产生几个副本，这取决于它们是如何被调节的。通常，复制控制被称为“放松”或“放松”。严格的这取决于是否让奥分别受到RNA或蛋白质的正调控。一个质粒的拷贝数与正调控和负调控之间的平衡有关，并且可以通过复制子中的突变来操纵。例如，pMB1让奥每个细胞维持大约20个拷贝，而pUC- - - - - -只有两种突变- - - - - -每个细胞将产生多达700个拷贝。
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| 图1:质粒图显示质粒的标准特征。 |
那么，你如何选择呢?Addgene的资深科学家马西·帕特里克表示，研究人员在开始前可以问自己几个问题:
- 质粒会被专门用于吗大肠杆菌？革兰氏阴性菌?革兰氏阴性和革兰氏阳性?
- 你的细胞中每次只有一种质粒类型吗?
- 你想制造很多质粒吗?
- 这种基因在大量使用时是有毒的吗?k总是好的请记住，在适当的条件下，低到中拷贝数的质粒仍然可以表达大量的蛋白质启动子和生长条件。
明智地选择复制的起源，避免质粒不相容
换句话说，最好的选择让奥这取决于你想要维持多少质粒副本，你打算使用哪个或哪个宿主，以及你是否需要考虑你的质粒与一个或多个其他质粒的兼容性。一般来说,同样的质粒让奥是不相容的因为他们将竞争同一种机制，创造一个不稳定和不可预测的环境。一般来说，来自同一组的质粒不应共同转化，所以如果你需要两个质粒做实验，请确保它们“兼容”让“，详见下表。
| 常见的向量 | 拷贝数+ | 让奥 | 不相容组 | 控制 |
| 举办的 | ~ 500 - 700 | pMB1(导数) | 一个 | 放松 |
| pBR322 | ~ 15 - 20 | pMB1 | 一个 | 放松 |
| 宠物 | ~ 15 - 20 | pBR322 | 一个 | 放松 |
| pGEX | ~ 15 - 20 | pBR322 | 一个 | 放松 |
| pColE1 | ~ 15 - 20 | ColE1 | 一个 | 放松 |
| pR6K | ~ 15 - 20 | R6K * | C | 严格的 |
| pACYC | ～10 | p15A | B | 放松 |
| pSC101 | ～5 | pSC101 | C | 严格的 |
| pBluescript | ~ 300 - 500 | ColE1(导数)和F1** | 一个 | 放松 |
| pGEM | ~ 300 - 500 | 举办F1和* * | 一个 | 放松 |
该表定义了常见的克隆载体，它们的拷贝数，让奥，和不相容组。注意A -C相容性分组是一个任意的命名，来自同一不相容组的质粒不应该共转化。
+实际拷贝数不同。请参阅下面的其他注意事项。
*需要pir基因进行复制(参考)．
**F1是噬菌体衍生的让奥这使得ssDNA的复制和包装成为噬菌体颗粒。质粒与phage-derived让“年代被称为phagemids．
影响质粒拷贝数的其他因素
虽然顺序和调节让奥显著影响质粒的拷贝数，其他外部因素也有作用。如果你打算净化你的质粒DNA，记住这些注意事项特别有用:
插入
- 如果含有大量的插入物或能产生有毒物质的基因，细菌倾向于保持更少的质粒副本。
的大肠杆菌应变
- 大多数大肠杆菌菌株可用于质粒的繁殖，但endA-大肠杆菌对质粒的高产量是最好的。
生长条件
- 通气量、温度、培养体积、抗生素和培养基都能影响拷贝数。一些让奥的温度敏感;其他人让奥可以被“欺骗”，通过添加氯霉素来扩增更多的副本- - - - - -确保你的成长环境没有对你不利!
文化培养液
- 新划线的细菌有更高的复制数量- - - - - -为了获得最佳结果，总是选择单个菌落直接从甘油砧木，琼脂刺，或液体培养传代。
- 新转化的细胞也能提供更高的质粒产量，这比从甘油砧木上分离出来的菌落更高。
- 12-16小时的孵育往往会带来更高的复制数，因为细菌刚刚达到静止期，但细胞还没有开始死亡。
有什么问题吗?需要澄清吗?如果有，请在评论中发表。此外，如果你对未来的质粒101系列主题有任何特殊要求，请告诉我们，并继续关注下一期。
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