作为分子生物学工具的细菌毒素-抗毒素系统

细菌世界的成员会产生各种各样的毒素来占领领地或杀死竞争的微生物，但你知道细菌也会产生对自己有毒的物质吗?

什么是毒素-抗毒素系统?

这些有毒物质是在细菌中广泛存在的毒素-抗毒素系统的一部分。它们由一种能影响多种细胞过程的毒素和一种抑制毒素活性的抗毒素组成。这些系统的关键是毒素是稳定的，而抗毒素是不稳定的，这意味着细胞必须不断产生抗毒素以避免细胞死亡。

就质粒而言，毒素-抗毒素系统就像“自私的”DNA片段，其唯一目的是确保自身及其相关基因的繁殖。这些系统能更好地保证质粒代代相传(图1)。这些所谓的“质粒成瘾系统”需要分裂细胞来保留质粒——如果一个细胞由于质粒分配不当而不能遗传质粒，它仍然会遗传一些毒素和抗毒素。然而，抗毒素会被降解，使细胞被更稳定的毒素杀死。细胞只有在保留质粒的情况下才能存活。

自从质粒成瘾系统被发现以来，质粒成瘾系统一直被作为生物工具广泛应用于分子生物学或其他领域在活的有机体内研究。让我们来看看质粒成瘾系统的多种类型及其应用。

发现毒素 - 抗毒素系统

毒素-抗毒素系统是在1983年，小仓光和平贺小田结果表明，如果一个迷你f质粒携带一个特异的700 bp DNA片段，则质粒比不携带该DNA的质粒繁殖得更好。

他们最终指定这个片段为ccdB地区(“coupledcl形的division”)。编码的毒素-抗毒素系统由CcdB(毒素)和CcdA(抗毒素)组成，其中CcdB通过结合DNA旋回酶GyrA亚基并将其捕获在裂解复合物中，从而推断DNA复制。这会导致DNA断裂和细胞死亡。相反，CcdA绑定并阻止CcdB的活动。

的应用ccdB在质粒克隆

CcdB最广泛的应用可能是门户网关^TM克隆,那里的ccdB基因是一种可反选择的标记在目标向量中。成功的克隆发生在ccdB基因被兴趣基因所取代。因此，保留ccdB基因的细胞会死亡，而含有ccdB基因的转化子的比例会更高ccdB表示“不”结构。

其他毒素抗毒素系统及其应用

迷宫/ MazF

除CcdB/CcdA外，还有许多基于蛋白质的毒素抗毒素系统。其中最著名的基于蛋白质的毒素抗毒素系统是迷宫/ MazF．毒素MazF是一种核糖核酸酶，它能切割RNA中的特定序列，从而阻碍蛋白质的合成。抗毒素迷宫绑定和抑制MazF，通过ClPap蛋白酶连续切割，因此在不连续地生产迷宫，毒素变得活跃。

沈阳的实验室利用了mazF作为可创建的反选择标记在酵母中没有标记的遗传修饰毕赤酵母属pastoris．通过将阳性选择和反选择结合在一个质粒上，他们能够创造一个高效的克隆工具。的质粒pKSCTMF包含了mazF基因和Zeocin抗性的基因（图2）。该MAZF-ZEOR盒侧翼侧由两种直接重复，可用于标记去除，从而可以重复使用标记以在同一菌株中引入多种遗传修改。MAZF表达处于AOX的控制下1甲醇诱导其表达的启动子。一旦线性化，可以通过选择Zeocin抗性，将递送载体集成到基因组中以引入其内含有的遗传修饰。然后，使用甲醇培养基的反次选择选择已经通过两张侧翼重复之间的第二重组事件去除盒的细胞。在未发生重组的细胞中，甲醇诱导导致细胞死亡的有毒母猪的产生。该团队使用此盒式纸盒敲除基因，敲入GFP盒式磁带，并引入了站点导向的突变，所有都没有引入不需要的选择标记。

限制修改系统

因为限制性修饰系统由两种具有反对活动的两种酶组成，因此它们也没有令人惊讶的是，它们也发挥毒素 - 抗毒素作用。限制性修饰系统由限制性内切核酸酶和甲基转移酶组成。限制性内切核酸酶在特定核苷酸序列或附近的DNA切割。为了计数器，甲基转移酶将甲基加入到特定核苷酸序列的基础上，防止了同源限制酶切割DNA。首先描述质粒添加中限制性内切核酸酶的作用的研究EcoRI和Bsp6I在大肠杆菌1995年，当质粒上引入限制性修饰系统时，与没有限制性修饰系统的质粒相比，细胞群保留了更多的质粒。

与上面描述的其他毒素-抗毒素系统一样，这一对中的一部分比另一部分更稳定。在这里，限制性内切酶比甲基转移酶更稳定。当质粒丢失时，甲基转移酶随着细胞生长而降解和/或稀释，导致染色体上出现未甲基化的位点。更稳定的内切酶可以切断染色体，导致细胞死亡。

反义RNA-regulated系统

毒素-抗毒素系统不仅仅局限于蛋白质领域。让我们来看看由反义RNA调控的毒素-抗毒素系统，反义RNA通过碱基对同源mRNA来抑制其翻译。

的hok / sok系统是第一次发现的反义RNA调节的毒素 - 抗毒素系统。与刚才描述的系统不同，HOK / SOK系统由三个组件组成：

1. 主机杀死(hok)，一种破坏细胞膜的长寿毒素;
2. 禁止杀害(目前)，一种短命的RNA抗毒素;
3. 杀害的调节（mok）， 需要hok翻译。

在这里，Mok和Hok翻译是耦合的。由Shine-Dalgarno (SD)序列翻译而来mok导致Mok和Hok的翻译，触发细胞死亡。然而,目前反义rna结合下游的序列mokSD导致双链RNA结构，被RNaseIII识别并切割，从而导致细胞存活。

质粒成瘾系统可以是用于驱动高蛋白表达的结构物的伟大补充在活的有机体内．如果没有质粒成瘾系统，表达质粒往往会丢失。例如，卡拉·莫林和詹姆斯·凯珀使用hok/sok系统创造能够稳定表达抗原的菌株足以产生免疫反应作为概念的证明，他们测试了一个勒克斯介导的生物荧光记者在活的有机体内在没有选择压力的情况下，发现质粒在5天后保持100%的稳定性。

杰夫·哈斯蒂和桑吉塔·n·巴蒂亚也使用了hok/sok毒素-抗毒素系统构建稳定的合成基因电路可以长时间使用。使用一个携带hok/sok毒素-抗毒素系统的质粒，他们能够在48小时内监测LACZ活动在体外没有抗生素选择。在皮下癌模型中，研究人员表明，24小时后，未经肥化的质粒在小于10％的细胞中保留，而含有质粒成瘾体系的质粒保留在75％的细胞中。它们能够将该系统应用为口服给药的诊断，其可以通过在尿液中产生可检测的信号来指示肝转移的存在。

质粒成瘾系统的底线

虽然这些系统在本质上是自私的，但研究人员已经将其应用于许多场合，例如需要在没有选择压力的情况下保留质粒，或用于长期实验。他们还帮助研究人员利用反选择设计和优化克隆方法。自从他们的发现以来，质粒成瘾系统已经成为解决一系列生物研究的有力工具。

参考

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