质粒制剂:不同纯度，不同数量，不同用途

由保罗Colombi

保罗Colombi2020年6月16日

并不是所有的质粒都是一样的。在从细菌培养物中纯化质粒之前，考虑一下你的实验是很重要的。它将决定你需要的DNA数量和纯度。基于这些前提，我们可以将质粒制备分为三种不同的方式:

DNA转换级
DNA克隆等级
DNA转染级别

图1:转化将转化级质粒引入细菌细胞。

DNA转换级

转换是在微生物中插入外源DNA的过程。化学和电活性细胞的细菌转化所需的质粒DNA的数量是最小的(皮克范围)。它可以从小型细菌培养物(即2-3毫升)中提取，有或没有商业可用的试剂盒，用于转化的DNA不需要像其他用途一样纯。

DNA克隆等级

分子克隆包括一套技术，用于将原核生物或真核生物的重组DNA插入合成载体，该载体可以有质粒或病毒来源。的克隆方法类型你的选择最终将影响所需的DNA数量，因此，也决定了所需的细菌培养和用于提取的商业试剂盒的大小。限制性内切酶基于基础的方法可能需要几百纳米或微克的起始材料;吉布森组装或金门组装使用更直接的方法，允许科学家从更少量的DNA (ng范围)克隆。

为了实现高效和完美的克隆，重要的是制备过程必须是由其他核酸(基因组DNA和RNA)、蛋白质和在纯化过程中使用的化学污染物纯净的。DNA纯度的良好指标是230,260和280 nm处的吸光度测量值。在260和280 nm处测量的吸光度比应该下降到~1.8 - 2，并给科学家一个纯度相对于蛋白质污染物的指示。260和230 nm的比例应降至~2 - 2.2，并提供了一个纯度指标，相对于在质粒提取过程中使用的硫氰酸胍和盐酸胍等chaotropic试剂。

图2:使用克隆级别DNA直接克隆你感兴趣的基因到质粒骨干。

DNA转染级别

图3:需要将质粒引入哺乳动物细胞?使用转染级DNA。

转染是将外部质粒插入哺乳动物细胞的过程，每次反应可能需要几微克的质粒DNA。因此，这项技术的准备工作必须规模更大，以允许提取足够的质粒来进行多次实验。

转染级DNA的另一个基本方面是纯度。除了不含任何核酸和化学污染物外，这些DNA样本还必须完全不含内毒素。内毒素是一种脂多糖类革兰氏阴性菌的细胞壁E．杆菌影响组织培养细胞系活力，降低转染效率，最终影响实验质量和结果。由于这些原因，市面上出售的试剂盒提供了额外的洗涤步骤，有利于去除这种试剂，以增加转染的成功率。

总之，提前确定你想要如何利用质粒DNA是很重要的，这样你就可以决定在数量和纯度方面质粒制备的最佳类型。