如果你要克隆一个质粒，你需要一种大海捞针的方法:从许多没有质粒的细胞中找到一个完美的含有质粒的克隆。一种开始寻找的方法是使用选择策略，即只有获得或失去特定基因的细胞存活(例如:抗生素抗性标记).在上一篇博文中，我们介绍了如何使用质粒克隆中的阳性选择和阴性选择．
但通常，选择策略本身并不足以帮助您找到所需的质粒。在很多情况下，你也需要一个筛选策略。在屏幕中，您不会像在选择中那样删除一部分单元格。取而代之的是，所有的细胞都存活下来，你需要对它们进行分类，以找到所需的克隆。
进行选择，然后选择屏幕
为什么要在克隆策略中添加屏幕？一个屏幕将帮助你更容易地识别成功的克隆，因此你必须在实验后清除更少的克隆。作为一个常见的例子，一次选择会留下包含质粒骨架的菌落，因为它通常依赖于抗生素耐药性。但是，如何识别包含所需插入的克隆呢？这就是屏幕出现的地方。
我们来看看全集成CRISPR/Cas9\u LacZ的CRISPR gRNA质粒林恩·波斯托维特实验室．它的骨架上有氨苄青霉素抗性标记。在含有氨苄西林的琼脂上进行选择，会产生携带这种载体的细菌，但它不会告诉你载体是否含有gRNA插入物。然而，蓝白色屏幕可以提供这些信息(下面有更多相关内容)。在含有X-gal的氨苄西林培养皿上进行转化，可以识别携带载体的细胞，并区分含有gRNA的质粒(白色)和不含gRNA的质粒(蓝色)。
让我们来看看几种筛选方法。
蓝白色的屏幕
一种广泛使用的筛选方法是蓝白色屏幕，它依赖于lacZ基因lacZ编码能水解乳糖的酶-半乳糖苷酶。幸运的是，对于实验室研究人员来说，当底物X-gal被-半乳糖苷酶分解时，它变成了一种不可溶的蓝色色素。
有些菌株含有lacZ科学家发现，当基因的一部分被删除时，会产生一种无功能的半乳糖苷酶。通过在质粒上表达该缺失部分来补充该突变，产生一种功能性半乳糖苷酶。蓝白色屏幕依赖于将感兴趣的基因插入细胞中部的载体lacZ基因，从而破坏半乳糖苷酶的活性。这些细胞，可能是你想要的细胞，不能分解X-半乳糖，是白色的。不包含插入的单元格为蓝色。查看我们的蓝白屏蔽更多信息，请发博客。
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| 图1：蓝白色屏幕的结果。来自斯特凡·沃科夫斯基． |
限制消化
另一种区分含有插入质粒的菌落和不含有插入质粒的菌落的方法是使用限制摘要．关键是对酶的选择要有策略。你会想要选择的酶，将给你不同大小的带取决于质粒是否包含你感兴趣的插入。例如，选择只在预期插入的任何一侧切割一次的酶。如果质粒包含插入物，您将看到两个条带:一个代表载体主干，另一个代表插入物。如果质粒不包含插入物，你只会看到载体骨干带。或者，你可以选择一种酶只在质粒主干上切割一次，另一种酶在插入物内部切割。如果质粒包含插入，你会看到两个条带，但如果质粒不包含，你只会看到一个条带。这些只是使用限制性消化筛选克隆的几个例子，但是有许多其他方法来选择限制性酶。
如果你打算走这条路线，请查看我们关于使用限制性内切酶分析质粒的协议视频，这可以帮助你可视化这一过程，或者访问我们的限制分析博客文章．
菌落PCR
菌落PCR可以检测DNA的存在或缺乏使用裂解的细菌菌落，而不需要准备质粒。在这种情况下，你会使用菌落PCR来检测插入物，要么使用特定于插入物的引物，要么使用特定于载体的引物，但放大潜在插入物。如果你使用插入特异性引物，如果质粒包含插入物，你应该期待PCR产物，如果质粒不包含插入物，则没有PCR产物。如果您使用的是载体特异性引物，请查找大小差异。您也可以使用底漆，其中一个底漆退火到插入和其他底漆退火到骨干。在这种情况下，如果质粒中没有插入物，就不能扩增任何东西。像任何实验一样，你需要正确的阳性和阴性对照。
查找详细信息并了解更多信息在这篇博客文章中．
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| 图2菌落PCR的步骤。 |
桑格测序
桑格测序确定了DNA分子中核苷酸的精确顺序，在本例中是质粒。排序是最可靠的方法之一，以了解您的插入是您所期望的。首先，你需要一个引物来补充你的质粒序列。从一个骨干特异性引物开始，它将在多个克隆位点(MCS)上排序，并进入您的插入。看看我们矢量数据库要找到更常用的主干和特定引物的质粒图谱，您可以使用它们来确认克隆。您还可以找到受欢迎的测序引物在我们的分子生物学参考。
有时，普通的初级读本不能提供您需要的所有信息，所以您需要设计一个定制初级读本。由于Sanger测序通常只能对1kb的DNA进行测序，因此定制引物在验证从两个末端测序都无法达到的突变方面特别有用。想知道更多吗？请访问此博客以了解更多信息分析和排除Sanger测序结果的提示．
在Addgene，我们现在使用QC过程中的下一代测序. 这样，我们可以确认整个质粒的序列。请注意，NGS验证比Sanger测序或上述其他技术更耗时。
在分子生物学中，将基因克隆到质粒中通常是一个数字游戏。通过使用各种筛选和选择技术，你可以增加找到正确克隆的机会。
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