用体内组装简化克隆

本文由分子生物学MRC实验室的Jake Watson和Javier García-Nafría贡献。

质粒克隆是任何分子生物学工程的重要组成部分，但往往也是实验过程中的瓶颈。目前大多数克隆技术都涉及到圆形质粒的组装体外，在将其转化为大肠杆菌传播。然而，虽然尚不广为人知，质粒组装是可以实现的在活的有机体内使用甚至在普通实验室克隆菌株中也存在的细菌重组途径。

这种固有的细菌重组途径，被称为reca独立重组，通过末端的短的同源序列将线性DNA片段连接在一起，并可能作为细菌DNA修复机制。该途径是普遍存在的，所有实验室都报道了成功的重组大肠杆菌到目前为止进行了测试。

将该途径作为克隆工具的使用在25年前首次被报道(道格拉斯和霍华德，1991年，布贝克等, 1993）．但为什么这种技术没有得到重视呢?低保真度聚合酶的载体扩增和合成较长寡聚体的成本可能都是可以避免的限制性内切酶克隆，当时更为禁止。随着这些限制不再是问题，细菌在活的有机体内克隆技术现在可以成熟了。

的在活的有机体内程序集克隆协议

我nV伊一个组装(IVA)克隆(Garcia-Nafria等, 2016)使用细菌重组途径，允许在转化前使用简单的两步2小时方案执行任何克隆程序（图1）。由于该方法不需要特殊试剂或纯化试剂盒，因此成本低，可立即被任何实验室采用。

所有程序都使用相同的三步协议:

• 片段一代-任何线性DNA片段都可以组装在活的有机体内只要它们的末端有同源序列。不管DNA是PCR扩增，还是限制性消化，甚至是合成基因。PCR是产生线性片段的主要方法，因为所需的修饰和同源区域可以编码在引物序列中。单个PCR可以包含多个质粒，例如不同模板的亚克隆基因。所有pcr反应均为18个循环，25 μl单管反应。如果你正在合成一个新的DNA片段，对同源臂进行编码，使其能够立即与线性化的矢量主干进行共转化。

• DpnI消化l - 1μDpnI加入到PCR混合物中以去除亲本DNA(37℃，15分钟)。这种酶专门切割甲基化的DNA，所以它会选择性地破坏模板，而不是新合成的序列，从而限制假阳性菌落的数量。

• 转换-线性片段被转换成大肠杆菌质粒组装(再循环)发生在活的有机体内．我们使用XL-10 Gold大肠杆菌，但已成功测试DH5a、TOP10和Mach1。没有普通实验室克隆株到目前为止都失败了。其中最重要的是菌株的转化效率:当要求细胞执行多个重组事件时，所有线性片段需要进入同一细胞。对于只需要一个或两个重组事件的简单克隆，自制10个感受态细胞⁷CFU/μg是完美的，但执行多重修饰将需要超能力(10⁹CFU /μg)细胞。

引物设计

利用特异性引物设计(图2)，IVA克隆可用于进行任何质粒修饰，从插入、删除、点突变到多个基因的复杂组装。每种修改类型的底漆设计如图2所示，下面将进行更详细的讨论。对IVA克隆的主要要求是精心设计的引物。大多数错误是由于错误的引物序列!

引物由两个区域组成:3 '端结合模板DNA进行PCR扩增，5 '端编码修饰和同源序列。首先设计模板的结合区域，与熔化温度(T_米)，所有引物约60°C。同源区长度应在20 bp左右，但需注意序列的T_米，作为一个更高的T_米进行更有效的重组。我们通常使用T_米在47-55°C之间的同源区域(使用低聚糖的计算器）．

插入- - - - - -如果要插入长度不超过100 bp的短序列，如表位标签，设计带有模板结合区域的引物，使其扩增远离插入位点。在每个引物的5 '端编码一半的新序列，并有重叠部分用于同源重组。

删除-为了去除质粒的一部分，需要订购结合在不需要的部分任一侧的引物，用于扩增载体序列的其余部分。通过添加与反向引物5'端互补的短序列来编码正向引物中的同源性。

诱变-跨旧密码子设计引物进行突变，扩增整个载体。新密码子和同源区域可以包含在任何引物的5 '端。

Subcloning-将基因从一个载体转移到另一个载体，只需将载体扩增，并在同一个PCR中插入不同的引物对。将同源序列加到其中一对引物上以驱动组装。

结合多个修改

IVA克隆的一个关键特征是能够结合多种修改。任何IVA引物都可以组合使用，只需将所有必要的引物添加到同一PCR混合物中，即可同时进行修饰。成对引物将在修饰位点之间扩增整个载体序列（见图3），产生具有特定同源末端的多个片段。这些碎片是组装起来的在活的有机体内生产多重改性产品。例如，通过结合多个引物，可以将c端表位标签移动到蛋白编码序列的n端，或者在基因中引入突变，同时添加gfp标签(图3)。

实现多重修饰需要多重重组事件来组装最终的质粒。使用IVA克隆至少可以正确组装5个片段，但组装效率会随着克隆复杂性的增加而降低。同源性越高，重组的效率越高，因此可以通过扩展同源序列(至25-30 bp)来辅助进行更复杂的程序。

IVA克隆的技巧和技巧

使用序列管理器

序列管理器，例如SnapGene，对确定底漆设计非常有帮助。

使用最小模板DNA

使用1ng的PCR模板DNA以减少假阳性菌落。我们通常只筛选两个菌落进行简单的克隆程序。

使用高保真度DNA聚合酶

这将最小化PCR过程中的随机错误:我们推荐Phusion或Q5。

加速你的生活

不必每次都配制你的聚合酶链反应混合剂，预先配制的含有缓冲液、聚合酶和dntp的混合剂可以冷冻保存:只需解冻并添加你的引物和模板。

放大“unamplifiable”

用凝胶电泳检查扩增情况。根据我们的经验，PCR后良好的扩增意味着成功的质粒组装(如果引物设计正确)。有些DNA序列不易通过PCR扩增，通常在PCR混合中加入DMSO(3%)和甜菜碱(1 M)。

当PCR不可行时

有些质粒就是不能扩增!这方面的例子是AAV基因组DNA编码质粒的富含gc的itr，或启动子，如pHLsec载体的鸡-肌动蛋白启动子。在这种情况下，IVA可以通过限制性内切酶将载体切割，并通过PCR将相应的同源序列添加到插入物中。

非常感谢来自MRC分子生物学实验室的嘉宾博客杰克·沃森和哈维尔·加西亚·纳夫里亚。

杰克·沃森是MRC分子生物学实验室神经生理学博士后研究员。他目前正在研究突触传递和可塑性的分子生物学。

Javier García-Nafría是MRC分子生物学实验室的研究员。他对神经元信号转导感兴趣，并使用电子低温显微镜来了解受体功能。

在推特上关注他们@jakefwatson和@JGarciaNafria．

工具书类

1.道格拉斯·琼斯和布鲁斯·H·霍华德。一种利用聚合酶链反应将同源端置于DNA上进行重组和位点特异性突变的快速方法。生物技术10.1(1991):62-66。PubMedPMID: 2003926．

2.布贝克，彼得，莫妮卡·温克勒，威尔弗里德·鲍奇。"体内同源重组快速克隆"核酸研究21.15(1993):3601。PubMedPMID: 8346047．公共医学中心PMCID: PMC331480．

3.加西亚·纳夫里亚、哈维尔、杰克·沃森和英戈·H·格雷格。“IVA克隆：利用细菌体内组装的单管通用克隆系统”，《科学报告》6（2016）：27459。PubMedPMID: 27264908．公共医学中心PMCID:PMC4893743．

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