CRISPR技术改变了科学家编辑和控制基因的方式，但根据布罗德研究所的西尔瓦娜·科纳曼(Silvana Konermann)的说法，第一代CRISPR- cas9质粒的设计并没有考虑到基因激活。她说:“我们还没有设法创造出一个系统，让我们能够可靠地激活任何基因。”从基因突变和失活到利用CRISPR系统选择性激活一个或多个基因，这是一个巨大的技术飞跃。她当时的问题是:你能设计出CRISPR-Cas9激活剂，使其在任何基因上都能发挥足够好的作用，使其能够被缺乏生物工程专业知识的人使用吗?
“这是高通量全基因组筛查的下一步，”Konermann说。“如果你想激活所有2万个基因，就不可能测试每个基因，并确保它有效。你只能用一个你真正有信心的系统来做筛选，对大多数基因和个体靶向模块都有效。在我看来，这两件事还没有实现。”直到现在。
进入SAM池库
发表在自然去年12月，科纳曼和她的同事在张峰的实验室描述了这样一个系统，他们称之为CRISPR/Cas9协同激活介质和山姆。SAM是一种用于内源性基因转录激活的工程蛋白复合物，由三部分组成:
1.核溶解失活Cas9-VP64融合;
2.在四环和茎环2上包含两个MS2 RNA适配体的sgRNA;
3.表达激活辅助蛋白的质粒MS2-P65-HSF1。
SAM可以与人类全基因组文库结合，激活RefSeq数据库中所有23,430种已知编码亚型。Konermann解释说，开发新系统的关键是对Cas9晶体结构的新认识。
“我想也许我们可以利用来自结构的信息来指导和改进激活器的设计，”她说。“以前，这有点像在黑暗中敲击键盘——需要大量的试验和错误。”
结构细节揭示了两个暴露的RNA环，Konermann认为这是融合激活子的理想地点，而不是在蛋白质的C端。有了这个新设计，Konermann立刻看到了一个数量级的提高，她知道她在正确的轨道上。
下一个观点是组装一个合成的转录激活复合物，由多个不同的效应域组成，协同工作，模仿自然转录激活过程。Konermann和她的同事通过筛选基因来展示这个新系统，当基因打开时，会使黑色素瘤细胞对BRAF抑制剂产生耐药性。(这个测试是一个完美的补充进行了早些时候由Zhang实验室提供壁虎这是一种慢病毒CRISPR文库，可以进行基因组规模的敲除筛选)。
作为张的实验室自然一篇论文报道说:“在这里，我们已经证明了SAM系统是健壮的，特异性的，当与一个紧凑的汇集sgRNA文库结合时，可以促进基因组规模的功能获得筛选。我们的sam介导的筛选结果显示了高度的一致性和有效性，每个基因命中>80%有效富集引导，前10个命中的验证率为100%。”
双向CRISPR筛选
10月份,乔纳森·斯曼的实验室引入额外的汇集CRISPR库，也可用于Addgene，使系统研究抑制或诱导单个转录本的细胞后果。激活子(CRISPRa) sgRNA库使用sunCas9系统，包含15977个人类基因中每个转录起始位点的10个sgRNA。转录抑制因子(CRISPRi)库包含了这15977个人类基因中每个转录起始位点的10个sgrna。
Weissman和他的同事在细胞它们通常可以在最小的脱靶效果下达到90-99%的击倒效果。该系统还使他们能够打开基因组中任何地方的基因，以进行1000倍范围的基因控制。
Weissman解释说，系统中有两个级别的控制。首先，Cas9s可以被打开和关闭，以可逆地激活或抑制感兴趣的基因。他说，他们还“表明，不同的引导rna具有不同的开启和关闭基因的能力”。“有的很强壮，有的比较温和;有一个等位基因序列，基因的开启和关闭程度取决于我们使用的引导RNA。我们现在要做的是更多地了解规则。”
他说，在理论上，一次可以操纵的基因数量是没有限制的。Weissman的团队已经推出了标准协议，目前他们正在努力进一步优化这些协议。他们还在开发sgrna，这将使基因表达水平和分析数据的软件更精细地调整成为可能。
将新文库应用于各种细胞类型和活小鼠应该是很简单的。对人类的治疗作用也在讨论之中。
“在未来，这是有潜力的，”他说。“我们必须优化如何提供这些工具，因为显然，与老鼠不同，我们不能依靠基因工程来优化人类的CRISPRi和CRISPRa。”
在您的实验中考虑使用池库之前，Addgene建议你检查一下使用慢病毒CRISPR库的步骤并记住以下几点:
- 这些库是合用的。这些可以用图书馆完成的大多数屏幕将需要使用下一代测序技术。
- 这些库是慢病毒性质的，所以请确保您配备和授权制作和使用慢病毒。另外，由于主干的大小，转换需要电穿孔。
参考文献及进一步阅读:
有关SAM的更多信息，包括一个工具来获得激活任何人类基因的优化指导序列，请进入http://sam.genome-engineering.org/．
晶体结构的Cas9在引导RNA和靶DNA复合物中。Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD，Konermann张芳，张丽娟，张丽娟。细胞生物学研究进展[j] .生物医学工程学报，2014,35(5):429 - 434。doi: 10.1016 / j.cell.2014.02.001。2014年2月13日。
基因工程CRISPR-的基因组级转录激活Cas9复杂。KonermannS, Brigham MD, Trevino AE, jung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F. Nature. 2015 1月29日;517(7536):583-8。doi: 10.1038 / nature14136。2014年12月10日。
公司CRISPR-基因抑制和激活的介导控制。Gilbert LA, Horlbeck MA, Adamson B, Villalta JE, Chen Y, Whitehead EH, Guimaraes C, Panning B, Ploegh HL, Bassik MC, Qi LS, Kampmann M，斯曼JS。细胞。2014 10月23日;159(3):647-61。doi: 10.1016 / j.cell.2014.09.029。2014年10月9日
留下你的评论