近红外荧光蛋白快速指南金宝搏app下载

这篇职位由Albert爱尔比斯坦医学院的一名教师博士·达利亚Shcherbakova贡献。

近年来，近红外荧光蛋白(NIR FPs)和生物传感器相继问世金宝搏app下载。作为许多此类探针的开发人员，我们决定写这个快速指南，以帮助研究人员选择他们需要的探针。你会找到关于近红外FPs的基本信息，它们的属性和应用。最后，有一个表总结了最先进的探针的特性，其中许多特性可以在Addgene上找到。

胆绿素发色团

近红外荧光蛋白（NIR FP金宝搏app下载S）源自掺入掺入BiliverdinIXα（BV）的天然光感受器。幸运的是，对于探测开发人员和用户，BV存在于真核细胞中作为血红素代谢的中间体(Shemetov et al, 2017)。现代最先进的近红外FPs可以像gfp一样通过向细胞提供单个基因来使用。仍然在细菌中，细菌不会产生BV, BV是一种额外的编码BV的基因应提供血红素加氧酶(Baloban et al.， 2017)。

考虑这一点很重要近红外FPs的有效亮度在细胞外，除了它们的分子亮度（荧光量子产率和消光系数的产​​物）（Shcherbakova等，2015）。有效亮度反映了细胞中含生物分子的浓度，并取决于通过诱导素和蛋白表达水平的BV掺入的效率。优化最先进的FPS（表1中列出的表1），以有效结合内源性BV。

在成像NIR FPS时，考虑使用在NIR中产生足够光强度的光源。通常，汞灯是次优，金属卤化物灯更好，而氙灯是在该光谱范围内工作的最佳选择。您还可以检查没有过滤器和/或冷视器阻止来自源头和相机的NIR光。

活老鼠新皮层中表达mirfp670nano3的神经元的双光子图像。图片由Axel Nimmerjahn(索尔克生物研究所)提供

多种用途:从多路复用到多尺度

nir -位移光谱非常适用于光谱多路复用(Shcherbakova et al.， 2018)近红外FPs可以与蓝光控制的光遗传学，如通道视紫红质和基于光氧电压(LOV)域的工具相结合。它们也可以用于无串扰三色图像绿色和红色的gfp类FPs (Shcherbakova等人，2016年)，以及四色成像(青色、黄色、红色和近红外)(Qian et al.， 2019)。

近红外FPs很有用在活的有机体内探针，由于低自身荧光，低散射和深穿透红移光。同样的近红外FPs和生物传感器可以在空间尺度上成像亚细胞进行了全身在小动物中，如小鼠(Matlashov等，2020)。

增强型miRFPs是单体且明亮

最近的系列增强单体近红外FPs命名为miRFPs(monomeric infrared FPs) (Matlashov等人，2020)从细菌光敏色素(BphPs)光感受器中提取，与之前报道的广泛使用的二聚体iRFPs相比，前者具有更高的细胞表观亮度(表1)。一般而言，探针的单体状态对融合伙伴的低聚体状态的干扰较小。因此，我们建议在您的应用程序中使用miRFPs及其名为emiRFPs的增强版本。

有一整套光谱上不同的(e)miRFPs可用。(e)miRFP名称中的数字对应于它们发射光谱的最大值。这些探头可以组合在双色和多色近红外成像中。

小miRFPnano

一个独立的近红外FPs类，命名为miRFPnanos，均来源于蓝藻细菌色素(CBCR)光感受器(Oliinyk等，2019)。它们被设计成包含BV。它们的优点是体积小(miRFPnanos为17 kDa, miRFPs为35 kDa, EGFP为27 kDa)，并且由于靠近N端和c端，有可能被用作内部标签。最新miRFPnanos⁹不要在细胞和分子亮度下产生（m）IRFP（表1）。

近红外记者和生物传感器

近红外报告可以通过蛋白质合成、降解或重组时发生的荧光变化来告诉我们细胞事件Shcherbakova等人，2018)。为了检测蛋白质 - 蛋白质相互作用，我们建议使用NIR基于miRFPs对记者进行了拆分（Shcherbakova等，2016），因为它们具有较低的背景和比以前开发的纳尔分裂探针更高的对比度（Tchekanda等人，2014，Filonov等人，2013)。

基于miRFP760-miRFP720 FRET对开发的FRET生物传感器，包括RAC1生物传感器(Shcherbakova et al.， 2018)和iGECI钙指标(Shemetov et al.， 2021)。除了FRET外，还开发了基于mIFP的强度钙指示剂NIR-GECOs⁶．了解更多关于近红外钙指示剂的特性、性能和应用最近的评论(Shcherbakova et al.， 2021)。

表1:现代近红外FPs的属性

结合了高细胞亮度和单体状态的最先进的近红外FPs用蓝色突出显示。^一个消光系数。^b量子产率。^c在哺乳动物细胞中确定。^d确定为瞬时转染的活的LeLa细胞中的有效的NIR荧光，没有供应外源性BV和归一化至共转染的EGFP的荧光后。^e最初报道为单体¹⁶，ifp2.0后来发现是一个二聚体^3、15．nd -不能与其他FPs平行测定。

我们希望这篇文章有助于您了解最先进的NIR荧光探针以及为您的实验选择完美的荧光探针！

感谢我们的客座博主!

达莉亚·施切尔巴科娃(Daria Shcherbakova)是爱因斯坦医学院的一名教员。她的专长是荧光蛋白、基因编码生物传感器和光基因工具的开发和应用。金宝搏app下载关注她最近的研究@daria_gift_shch。

参考资料

参考

1. Shemetov, A.A.， Oliinyk, O.S. & Verkhusha, V.V.如何提高哺乳动物细胞中近红外荧光蛋白的亮度。金宝搏app下载细胞化学杂志24，758-766 E753（2017）。
2. 巴洛班等人。设计更明亮的近红外荧光蛋白:结构和生化研究的见解。金宝搏app下载化学科学8，4546-4557（2017年）。
3. 基于细菌光敏色素的近红外荧光蛋白工程。金宝搏app下载CurrOpin Chem Biol2752 - 63(2015)。
4. Shcherbakova, d.m.， Stepanenko, o.v.， Turoverov, K.K. & Verkhusha, V.V.近红外荧光蛋白:多路复用和光遗金宝搏app下载传学跨尺度。生物科技趋势》36，1230-1243（2018）。
5. Shcherbakova, D.M.等人。明亮的单体近红外荧光蛋白作为标记和多尺度成像的生物传感器。金宝搏app下载Nat Commun712405(2016)。
6. 钱杨等。一种基因编码近红外荧光钙离子指示剂。NAT方法16，171-174（2019年）。
7. Matlashov，法医等人。一组用于跨尺度多色成像的单分子近红外荧光蛋白。金宝搏app下载Nat Commun11239(2020)。
8. Oliinyk, o.s.， Shemetov, a.a.， Pletnev, S.， Shcherbakova, D.M. & Verkhusha, V.V.最小的近红外荧光蛋白进化自蓝藻细菌色素作为光谱复用多功能标签。Nat Commun10，279（2019）。
9. Oliinyk, O.S.等。单域近红外蛋白为抗原依赖的荧光纳米体提供了支架。NAT方法提交（2021）.
10. 基于红外光谱的蛋白质-蛋白质相互作用的时空动态研究。NAT方法11, 641 - 644(2014)。
11. Filonov, G.S. & Verkhusha, V.V.近红外BiFC报告蛋白-蛋白相互作用的活体成像。细胞化学杂志20., 1078 - 1086(2013)。
12. Shcherbakova, d.m.， Cox Cammer, N.， Huisman, t.m.， Verkhusha, V.V. & Hodgson, L.通过近红外FRET实现Rho GTPases的直接多重成像和光遗传学。Nat Chem Biol.14, 591 - 600(2018)。
13. 谢梅托夫等人。近红外基因编码钙指示剂在体内成像。生物科技Nat》39, 368 - 377(2021)。
14. 近红外和远红基因编码神经元活动的指标。J >方法362109314(2021)。
15. Yu, D.等。一种用于体内蛋白质标记的天然单体红外荧光蛋白。NAT方法12, 763 - 765(2015)。
16. Piatkevich, k.d等。一种应用于荧光电压报告器的机器人多维定向进化方法。Nat Chem Biol.14, 352 - 360(2018)。
17. Yu, D.等。一种改进的神经元和肿瘤脑成像的单体红外荧光蛋白。Nat Commun53626(2014)。
18. 近红外荧光蛋白在多色活体成像中的应用。金宝搏app下载NAT方法10, 751 - 754(2013)。
19. Filonov, G.S.等人。用于活体成像的明亮稳定的近红外荧光蛋白。生物科技Nat》29，757-761（2011）。