在Addgene，我们很喜欢绿色荧光蛋白，当存款人找到新的方法使这种主要蛋白质变得更有用时，我们总是感到兴奋!从针对氧化环境优化的FPs来光转换变体，似乎GFP总是在学习新东西。现在，从康妮·塞普科实验室允许研究人员仅在GFP存在的情况下激活转录或Cre重组酶活性。这些系统被称为T-DDOG和Cre-DOG，分别将流行的GFP报告线用于更复杂的实验操作，节省了开发新线所需的时间和金钱。
利用纳米体构建GFP转录激活支架
该项目一开始就遭遇了许多研究人员的挫折：他们想问和回答实验性问题，但却没有这样做所需的工具。Cepko实验室的研究人员Jonathan Tang想在小鼠的单细胞类型中表达多种蛋白质，但他知道要开发出用于此目的的小鼠系需要几年时间。唐想知道他是否可以利用以前建立的在特定细胞类型中表达GFP的小鼠细胞系来做更多的事情，而不仅仅是标记细胞。如果GFP可以被增选来控制基因表达，那么他就可以选择性地只操纵GFP标记的细胞。
当唐和赛普科发现了gfp结合纳米体的描述后，这个项目真正开始了。与大多数抗体不同的是，在骆驼体内自然形成的纳米体由单一的重链组成，它们在细胞内很小，很稳定。结合GFP的纳米体设计于2009年。随后的研究表明，纳米体可以与其他蛋白质融合，而且这些融合保留了与GFP结合的能力。
用绿色荧光蛋白作为支架的想法突然变得非常现实。设想绿色荧光蛋白作为促进二聚的底物，Tang等人。测试他们的GFP结合蛋白(GBPs)对，以发现那些可以共同占据GFP的蛋白。一旦他们找到了合适的配对，他们就构建了三个组成部分:GBPa-VP16(激活域);GBPb-GAL4(dna结合域);和一个UAS-driven荧光素酶记者构造。在没有GFP的情况下，在他们的293细胞培养系统中没有观察到报告输出。在与GFP和GBPs共转染的细胞中，GFP将两个GBPs连接在一起以产生一个完整的转录因子，激活荧光素酶转录。Tang等人发明了这个系统T-DDOG(TranscriptionalDevicesD依附OnGFP）。
在测试他们系统的特异性时，Tang等人发现YFP和CFP可以激活某些T-DDOG结构类似于GFP，但常用吗红色荧光金宝搏app下载蛋白dsRed、mCherry和TdTomato不诱导转录。因此，T-DDOGs可以与绿红色结合使用Cre-lox系统。t - ddog也可以设计其他dna结合域，包括常用的LexA和rTetR使它们激活来自不同启动子的基因表达的系统。
移动到一个在活的有机体内系统，Tang等人。将T-DDOGs、GFP和一个报告构建物电穿孔到小鼠视网膜中。GFP表达强烈激活了报告基因TdTomato，在没有电穿孔GFP的情况下，该基因的表达缺失。然后，他们用两条小鼠GFP报告线测试T-DDOGs；同样，TdTomato仅在含有GFP的细胞中出现，激活频率高达56-93%。在相反的测试中，98%的TdTomato表达细胞为GFP+，表明这是一个稳健但特异的系统。T-DDOGs还成功调节了通道视紫红质-2，常用于光遗传学，为在特定细胞群体中进行光遗传学实验提供了可能。
将Cre和GFP与creo - dog结合
T-DDOG结果显示，GFP可以以细胞类型的特定方式调控转录，Tang和Cepko迫切希望看到，他们是否可以将GFP调控应用于其他类型的蛋白质。他们从另一种生物工作开始，Cre重组酶哪一个诱发复合在LoxP网站。放置lox-STOP-lox当Cre缺失时，相关基因上游的盒阻断转录。当Cre存在时，它移除停止盒，激活基因表达。
虽然Cre不是一种模块化蛋白质，Tang等人能够创建一个分裂版本的Cre，只有当GBPs/GFP二聚时才有活性。新系统creo - dog (CreD依附OnGFP）被GFP及其衍生物GFP和YFP激活，但不被T-DDOGs所见的红色荧光蛋白激活。金宝搏app下载
和T-DDOGs一样，creo - dog既健壮又专一。在视网膜电穿孔实验中，约76%的GFP+细胞诱导了DsRed报告基因表达，100%的DsRed+细胞也表达了GFP。使用AAVTang等人发现Cre犬可以在整个神经系统中传递，包括运动皮层、小脑和脊髓。Cre犬也适用于光遗传学研究，由于感染AAV Cre犬的细胞保留正常的神经元功能，该系统可能使特定细胞群的光遗传学更加容易。
优势和其他可能性
很明显，creo - dog和t - dogg为gfp标记的品系开辟了许多新的可能性，而且它们各自都有自己的优势。使用rTetR系统可以使t - dogs具有药物诱导性，但creo - dog缺乏高水平转录激活域的毒性。这两个系统都很容易适应神经科学的应用，包括光遗传学，它们应该使神经系统的功能研究更容易进行。
更广泛地说，Cepko和Tang指出，他们的支架系统可能适用于多种类型的蛋白质。对于具有模块化结构的蛋白质，构建分裂变异应该相对简单，但也有可能创建非模块化蛋白质的分裂版本，如Cre。可以Cas9dog是否会很快被开发出来，只允许对一小部分细胞进行基因组修改?其他的蛋白质也可以用作支架，包括红色荧光蛋白组。金宝搏app下载
的T-DOGGs和Cre-DOG可以从Addgene获得，我们渴望看到你如何在你的研究中使用它们!
工具书类
1.Tang, Jonathan C.Y., et al. “A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation.”单间牢房154(4) (2013): 928-939. PubMedPMID: 23953120．公共医学中心PMCID:PMC4096992．
- 从本出版物中找到质粒在Addgene。
2.依赖gfp的Cre重组酶的细胞类型特异性操作。Nat。>。18(9) (2015): 1334-1341. PubMedPMID: 26258682．
- 从本出版物中找到质粒在Addgene。
3.Kirchhofer，A.等人，“使用纳米体调节活细胞中的蛋白质特性。”纳特。结构。摩尔生物。17 (2010): 133–138. PubMedPMID: 20010839．
4.Caussinus，E.，Kanca，O.，和Affolter，M.“抗GFP纳米体介导的荧光融合蛋白敲除。”纳特。结构。摩尔生物。19 (2012), 117–121. PubMedPMID:22157958．
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