你已经从Addgene获得了编码你感兴趣的蛋白质的质粒，将其转染到目标细胞中，然后呢?你怎么知道你如此热衷于研究的蛋白质是否在你的细胞中表达?免疫印迹法或简单的western印迹法是检测蛋白质是否存在的最简单的方法之一(Renart等人，1979年,Towbin等人，1979年,伯内特等人，1981年）．
蛋白质印迹法简介
在西方，蛋白质是:
(1)按大小分开，
(2)转移到膜上，并且
(3)检测使用抗体.
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| 图1:Western blot过程概述。从蛋白质混合物开始，它在凝胶中分离，转移到膜上，用抗体染色，并显示出来。 |
这个过程可以让你在从细胞或组织中提取的复杂混合物中检测出单一的、特定的蛋白质。western western不仅可以检测蛋白质的存在或缺失，还可以确定蛋白质在一个系统中是上调还是下调，检测翻译后修饰，定量蛋白质水平相对于标准，检测蛋白质的细胞位置，并可作为蛋白质相互作用研究的读数，如免疫沉淀和下拉试验。
西部片分为两类，本土的和变性的。在一个土生土长的西部，蛋白质的二级和三级结构保持完整，蛋白质被电荷通过基质分离。在一个变性西药，蛋白质变性为其一级结构并按大小分离，更小的分子在基质中移动更快。为了这个博客的目的，我们将重点关注变性西部片。
按大小分离蛋白质混合物
十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是西方的第一步。为了制备SDS-PAGE的样品，测量蛋白质含量并使常规化以确保等效的负载。通过沸腾在通常含有硫醇的还原剂的存在下使它们对其主要氨基酸序列的样品变性，以裂解二硫键。将样品，每泳道一个样品，在分离凝胶的顶部上，由交联聚合物丙烯酰胺组成。除了样品之外，单独车道中已知分子量的蛋白质标准可以帮助确认感兴趣的蛋白质的尺寸。施加到凝胶的电流使带负电荷的蛋白质朝向凝胶底部的正电荷迁移并分开尺寸。
较小的蛋白质在丙烯酰胺基质中遇到的阻力较小，在凝胶中迁移得更快。为了更好地分离蛋白质，改变凝胶中丙烯酰胺的含量。对于小的蛋白质，使用更高比例的丙烯酰胺来增加迁移阻力和改善分离。对于大的蛋白质，减少丙烯酰胺的百分比。
为了进一步提高分辨率，在分解凝胶上使用堆叠凝胶。与溶解凝胶相比，堆积凝胶通常具有不同的离子强度、较低的pH值和丙烯酰胺含量。在这些条件下，样品中的所有蛋白质都以相同的速度通过堆积凝胶迁移，并同时进入溶解凝胶，在那里它们被大小分开。梯度凝胶是提高分辨率的另一个很好的选择。在这种设置下，凝胶从上到下的丙烯酰胺含量范围不断扩大，允许在单个凝胶上分离出大小范围广泛的蛋白质混合物。
固定在膜上的蛋白质
一旦分离，蛋白质被固定在膜上，通常由硝化纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）组成，步骤称为蛋白质转移。虽然硝化纤维素和聚偏氟乙烯都是常用的，但聚偏氟乙烯由于其耐用性和高结合能力而更受欢迎。此外，PVDF膜可以反复剥离抗体，并用不同的抗体进行重组，从而可以从一个单独的样本中评估多个靶点。
有几种不同的蛋白质转移步骤包括湿法、半干,干但都遵循相同的一般原则,凝胶和膜“夹”在一起用吸墨纸和电流应用导致蛋白质的凝胶迁移和附着在膜。
在一个湿传输系统三明治完全浸没在填充有配制的转移缓冲器的罐中以进行电流。湿转移过程在转移广泛的蛋白质尺寸时非常有效，但需要几小时待过夜。
相比之下，一个半干转移只需要足够的缓冲液使三明治饱和，通常需要不到一个小时。然而，使用这种方法，大蛋白通常不会转移。
最后，商用印迹干燥系统在没有任何转移缓冲液的情况下有效地在几分钟内转移一系列蛋白质尺寸。然而，这些系统要求您购买昂贵的系统特定的三明治。
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| 图2:western blot干燥装置包括一叠滤纸、阳极铜/印迹铜凝胶基质、印迹膜、凝胶、阴极铜/印迹铜凝胶基质和滤纸。很像真正的三明治!S ' mores图像从埃文·阿莫斯. |
转移后，细胞膜的一些区域仍然没有被蛋白质结合。这些未结合区域具有“粘性”，并有可能非特异性地与用于染色的抗体结合。为了解决这个问题，在染色之前，将细胞膜置于含有脱脂牛奶、牛血清白蛋白或其他蛋白质的缓冲液中孵育。膜上的粘性区域会与缓冲液中的蛋白质结合，在染色过程中阻止膜与抗体结合。理想的阻断缓冲液取决于使用的抗体和标签，可能需要一些试验和错误(Yang et al.， 2012).
选择你的主要抗体
一旦膜被阻断，它就会被一种针对你感兴趣的蛋白质的一级抗体染色。但是你应该使用哪种抗体呢？你可能会从不同的供应商那里找到几种针对你感兴趣的蛋白质的不同抗体选择，你甚至可能会发现编码来自addgene的抗体的质粒你可以自己做。
要缩小搜索范围，请首先注意供应商网站上列出的已验证应用程序，并选择已验证用于免疫印迹的抗体。不同的免疫分析检测不同状态的蛋白质。例如，在免疫沉淀（IP）中，抗体在其天然状态下与蛋白质相互作用，而蛋白质印迹检测变性多肽链。可用于抗体结合的蛋白质区域或表位在天然状态的蛋白质与多肽链之间不同。因此，经验证的IP抗体可能不适用于西方人，反之亦然。
除了经过验证的应用程序，还要密切关注供应商网站上列出的控制。通常，供应商会证明他们的抗体与正确大小的蛋白质结合。许多供应商将证明抗体与瞬时过表达蛋白结合，然而，他们也应该证明抗体在生理相关水平上有效地与内源性表达蛋白结合。一些供应商还将在各种组织中测试他们的抗体，以证明蛋白质染色符合预期的跨组织表达模式。最近，敲除或敲除细胞株已成为抗体验证的金标准。这种级别的验证确保了抗体对预期靶点的染色。
一旦选择抗体，彻底读取数据表。供应商经常包括用于工作浓度，阻塞缓冲液和孵化时间的建议。如果供应商包括引用抗体的出版物，请考虑审查这些出版物的材料和方法。
最后，一定要验证所选抗体在你的特定实验环境下是否有效(Pillai Kastoori等人，2019年).除供应商用于验证的组织或细胞系外，其他组织或细胞系可能含有非预期交叉反应蛋白。类似地，如果您改变供应商使用的实验条件，则可能导致非特异性绑定。
尽可能包括阳性和阴性对照。阳性对照通常包括已知在生理相关水平（非过表达系统）表达蛋白质的细胞系或组织，而阴性对照则是那些不自然表达蛋白质或基因表达被敲除或敲除的细胞系或组织。如果您有兴趣制作自己的淘汰线进行验证，请查看本教程斯图尔特·奥金和丹尼尔·鲍尔的实验室
在二级抗体的帮助下想象你感兴趣的蛋白质
为了观察膜上的蛋白质，抗体通常与酶结合，如辣根过氧化物酶（HRP），该酶在与特定底物反应时发光。发射的光，或化学发光，通过x射线胶片或特定的成像设备检测。在大多数情况下，与感兴趣的蛋白质结合的一级抗体没有标记。相反，一种结合的物种特异性二级抗体被用来可视化蛋白质。在此装置中，多个二级抗体分子结合一级抗体并放大检测信号。
蛋白质印迹分析
一旦可见，就可以分析你感兴趣的蛋白质了。分析通常首先确认与蛋白质标准相比，蛋白质是预期大小。
蛋白质丰度
此外，条带的厚度提供了样品中蛋白质相对丰度的信息。蛋白质越多，条带越厚，蛋白质越少，条带越薄。然而，值得注意的是，在评估蛋白质丰度或比较不同车道的样品时，必须包括负载控制。
典型的负载控制方法是用抗体探测细胞膜，以检测无处不在的表达蛋白，如肌动蛋白。凝胶上所有样品的肌动蛋白水平应该是一致的，并且应该在所有样品中观察到大小和密度一致的条带。样品加载不均匀或蛋白质转移不完全导致加载控制水平不一致。在这些情况下，西方应该重复。
最后，虽然西餐是一种测量蛋白质丰度的有用方法，但它们提供了定性测量。如果你需要蛋白质的精确定量，可以考虑使用其他方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA) (Aydin等人。，2015年）．
翻译后修改
除了蛋白质丰度外，western还检测蛋白质翻译后修饰的变化，如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。例如，要测试一种蛋白质是否在特定的实验条件下被磷酸化，你可以在治疗前后寻找蛋白质带的轻微大小变化。
西部片也是许多细胞分析的有用读数。它们可以确定免疫沉淀后的蛋白质相互作用，是亚细胞分馏的常见读数，亚细胞分馏是一种从线粒体、细胞质和细胞核等不同细胞室分离蛋白质的程序。
我们希望这篇博客为您提供了Western Blot的良好概述。在计划西方时，注意包括适当的阳性和阴性对照，选择验证的抗体，并在特定系统中测试抗体。如果您发现此博客有用务必务必退房Addgene的博客有关其他抗体主题的概述。
资源和引用
参考
Aydin S（2015）简要介绍了ELISA的历史、原理和类型，以及我们使用ELISA进行肽/蛋白质分析的实验室经验。肽72:4-15。https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012
Burnette WN(1981)“Western Blotting”:从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中蛋白的电泳转移到未修饰的硝化纤维素，并用抗体和放射性碘化蛋白a进行射线照相检测。分析生物化学112:195-203。https://doi.org/10.1016/0003 - 2697 (81) 90281 - 5
Pillai Kastoori L、Heaton S、Shiflett SD、Roberts AC、Solache A、Schutz Geschwender AR（2019）Western blot抗体验证：由用户进行，由用户进行。生物化学杂志295:926–939。https://doi.org/10.1074/jbc.ra119.010472
Renart J, Reiser J, Stark GR(1979)蛋白从凝胶转移到重氮苄氧甲基纸和抗血清检测:一种研究抗体特异性和抗原结构的方法。美国国家科学院院刊76:3116-3120.https://doi.org/10.1073/pnas.76.7.3116
从聚丙烯酰胺凝胶到硝化纤维素的电泳转移:过程和一些应用。美国国家科学院院刊76:4350-4354。https://doi.org/10.1073/pnas.76.9.4350
Yang P-C, Mahmood T (2012) Western blot:技术、理论和故障排除。北方医学科学4:429。https://doi.org/10.4103/1947-2714.100998
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话题：分子生物学协议和提示,抗体
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