在实验中使用FRET的提示

我第一次听到FRET是在一个杂志俱乐部，我的吉他手的大脑自动地想到在我的吉他颈上发现的凸起元素……你会说这对生物学家没什么用。这个学生当然是在谈论现在众所周知的事情FRET，即荧光(Förster)共振能量转移这项技术可以检测分子间的相互作用、修饰或解离原位．自90年代中期使用以来，这项技术彻底改变了我们理解分子复合物的方式，至今仍是一个非常有用的工具。

就像一个吉他英雄(我不是)，FRET喜欢“现场演奏”。事实上，FRET是最早使用显微镜测量活细胞中单个分子相互作用的技术之一。过去，分子间的相互作用是通过间接手段检测的，通常使用具有靶向几个分子潜力的探针。打个比方，这就像在大学大厅里指着一群学生，却不知道这些学生是否认识或相互交流。FRET降低了我们对分子相互作用的认知。

烦恼是什么?

在他们的杰西博2003年的论文， Sekar和Periasamy将FRET定义为“一个依赖于距离的物理过程，通过分子间的远距离偶极-偶极耦合，能量从一个受激的分子荧光团(供体)非辐射转移到另一个荧光团(受体)”。受体荧光团的发射可以用显微镜技术测量。FRET测量灵敏度高，适用于研究活细胞内的相互作用。通过将荧光团与蛋白质偶联，这项技术的先驱能够直接检测活细胞中的蛋白质/蛋白质相互作用。自那时起，FRET也被用来测量构象变化，裂解活性使用FRET-based生物传感器,DNA和蛋白质之间的相互作用。FRET在理论上是一项简单的技术，但遵循一些简单的规则以避免常见的陷阱并以最佳状态使用它是非常重要的。

影响FRET的参数是什么?

当使用的两个荧光团靠近时，就会发生FRET。因此,两个荧光团之间的距离以及它们彼此之间的方向会影响烦恼。当涉及到研究两种蛋白质之间未知的相互作用时，这些参数很难克服，但在分析FRET实验数据时必须考虑到它们。你可能必须设计几个不同的构念来找到一个可以用于你的研究目的。这些参数在设计时不那么重要生物传感器，因为两个荧光团之间的距离和它们的空间方向是固定的。

的供体的量子产率(每吸收光子发射的光子数)和受体的消光系数(将给定波长下吸收的光的数量与溶液中荧光团的浓度联系起来)是影响FRET效率的另外两个参数。这些问题可以通过选择一个补充来克服一双荧光团．为了使FRET信号最大化，你应该选择最高的量子产额供体，最高的吸收受体和光谱中有显著重叠的荧光团。CFP-YFP是第一对被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的基因对，此后还使用了其他几对基因对，包括:mCerulean/mVenus，mCerulean/琥珀色的，mCerulean/SYFP2A，mTurquoise/mVenus和其他人。CFP-YFP仍然是测量FRET最好和最常用的对之一。

下表列出了可用于创建您感兴趣的荧光融合蛋白的质粒:

其他影响FRET测量的问题包括:一个荧光团对的亮度，供体:受体的化学计量，以及两个荧光团颜色之间的交叉。FRET的专家建议使用两个亮度相似的荧光团——即使在最流行的一对荧光团中，CFP的亮度比YFP低五倍。给体与受体的化学计量很难确定，特别是在研究未知分子配合物时。但在分析FRET结果时，这是一个必须记住的参数。两个荧光团之间的串扰与它们的激发光谱重叠有关。如果你在光谱中选择一对彼此太近，你可以很容易地直接用用来激发供体的激光激发受体。在这种情况下，串音是高的，您的背景信号可能比能量转移产生的信号高。相反，如果你选择一对彼此太远的，你不会有任何相声，但你也不会有任何共振转移。你必须在FRET效率和串音之间找到平衡。

细胞生物学研究中FRET的测定方法

几种方法在过去的20年里使用过吗来测量FRET，没有一个比另一个更好。当第一次开始为一个特定的实验建立FRET方法时，FRET专家经常建议使用尽可能多的测量方法。然后您可以为自己的系统选择最有效的方法。

最简单和最流行的一种方法是敏化发射方法，在该方法中，给体被特定波长的光激发，并使用为给体荧光和受体荧光选择的发射滤波器来收集信号。此外，如果FRET对之间没有串扰，此方法可能是最佳选择。不幸的是，在现实世界中，荧光团之间确实存在交叉，纠正方法和适当的控制需要做这个吗该方法适用于FRET变化较大的动态实验。

另外两种方法通常用于测量FRET：受体光漂白法和荧光寿命成像显微镜(FLIM)法。

受体光漂白方法

受体光漂白方法简单，但仅限于一次测量。这种方法是基于当FRET发生时供体被淬灭的事实。通过光漂白受体，释放供体的猝灭，供体的荧光增强。这种方法是直接和定量的，但它是破坏性的，不能用于动态测量。必须格外小心，以免破坏供体分子。

荧光寿命成像显微法

FLIM是最近才发展起来的，是测量FRET最严格的方法。FLIM测量供体的荧光衰减时间。当电子对之间发生FRET时，施主荧光被猝灭，施主荧光衰减时间缩短，使得FLIM给出一个明确的FRET效率值。由于不测量受体荧光，这种方法对直接受体激发伪影也不太敏感，因此可以使用非荧光受体。值得注意的是，FLIM是一种较慢的成像方法，这限制了它在许多FRET实验中的使用。此外，其他环境因素，如pH值或自身荧光背景会改变荧光衰减时间，在解释数据时必须考虑。

FRET已经20岁了，但你可以想象，它一点也不过时。随着新的荧光对的发展和快速测量系统的出现，这项技术仍有许多美好的日子和良好的“gigs”的前面…无意冒犯BRET, CRET和其他RET技术，它们从未超越大师。

注意:

• 生物发光共振能量转移
  
  
• 化学发光共振能量转移
  
  

关于FRET的有趣文章:

• 活塞DW, Kremers GJ。荧光蛋白FRET:好的，坏的和丑陋的。趋势生物化学科学。2007年9月;32(9): 407 - 14所示。
  
  
• FRET基础与应用:一个EAMNET教学模块http://www.embl.de/eamnet/downloads/modules/FRET_teaching_module.pdf
  
  
• 第一天注册护士，戴维森MW。金宝搏app下载荧光蛋白荧光显微镜:监测活细胞中的蛋白质相互作用。Bioessays．2012年5月;34(5): 341 - 50。doi: 10.1002 / bies.201100098。
  
  
• Sekar RB, Periasamy A。荧光共振能量转移(FRET)显微镜成像活细胞蛋白定位。J细胞．2003年3月3;160(5):629 - 33所示。