用AAV进行神经元追踪

神经元示踪的背景

了解大脑功能的一个关键方面是了解它的结构，特别是大脑不同区域之间的连接。例如，海马体和前额皮质之间的交流参与了情景记忆的形成，情景记忆是一种特殊类型的记忆，包括自传体事件(参见Jin & Maren, 2015）.大脑不同部位之间的信息定向流动是由单个神经元介导的。神经元是由细胞体和接收信息的树突和向其他神经元细胞发送信息的轴突组成的。轴突末端的突触与近端神经元细胞的树突形成连接。在情景记忆的具体例子中，海马神经元的一个子集将轴突直接投射到前额皮质，但也通过突触间接投射到大脑其他区域的神经元。此外，各区域之间的连接通常是相互的，形成一个神经元回路，在记忆形成和记忆提取过程中被激活并加强。

在神经元追踪实验中，大脑组织被注射一些化合物，这些化合物会在细胞内扩散开来，帮助观察单个神经元的形态，包括树突和轴突的延伸，最重要的是，观察神经元与其他大脑区域的任何连接。沿着信息流的方向追踪化合物以勾勒出神经元的轮廓是可取的，以便了解哪些大脑区域相互沟通，以及它们是如何进行沟通的(例如，信号来自哪里，它们的信号可能具有什么含义)。顺行示踪勾勒出神经元从细胞体到轴突末端的轮廓;而逆行描摹则从相反的方向描绘出神经元，从轴突的末端到细胞体。

顺行示踪和逆行示踪利用了神经元中现有的运输通路。顺行运输通常用于细胞器(如线粒体)、大分子(如肌动蛋白和肌凝蛋白)和酶(用于传递素合成)的运输。逆行转运用于转运靶向降解的内吞物质或分子。这两种途径也使用不同的细胞骨架机制来促进转运:逆行转运依赖于动力蛋白，而顺行转运依赖于动力蛋白。不同形式的逆行和顺行运输的不同速度表明存在一些平行机制(回顾见Maday等人，2014)。目前尚不清楚哪些蛋白质有助于神经元示踪化合物的运输，这是一个需要进一步研究的领域。

传统的神经元追踪方法

传统的示踪化合物要么产生比色产物，要么是荧光的。虽然染料通常是单向传播的，但也有一些报道是双向传播的。对于主要的顺行示踪，生物素化葡聚糖胺(Veenman et al.， 1992)或荧光分子如rhodamine-isothiocyanate(RITC;Thanos et al.， 1987)。对于主要的逆行示踪，用辣根过氧化物酶(HRP;Kristensson和Olsson, 1971)，植物凝集素(麦胚凝集素WGA, Schwab et al.， 1978)或荧光分子如Fluoro-Gold (Schmued and Fallon, 1986)。

以促进细胞吸收这些染料在活的有机体内可以采用微注射、压力注射或离子电泳(通过插入电极施加小电流)，但这些方法可能会对细胞健康产生负面影响。传统追踪化合物的另一个局限性是，它们在突触间隙的扩散通常会受到严重损害，关于染料分子在突触处从一个神经元传输到另一个神经元导致微弱信号的报道很少(Schwab et al.， 1979;Buttry & gosharian, 2015）.然而，在过去的几十年里，这些示踪剂的使用对于建立我们目前对神经解剖学和神经连接性的理解至关重要，为神经元通信提供了有价值的见解。

188完整比分直播病毒载体和神经系统

随着…的到来病毒载体技术在美国，研究神经元连通性的新方法已经被开发出来。这些方法的神经毒性较小，与其他神经科学方法如电生理记录更好地兼容。这些方法的起源是自然发生的病毒，它们感染、持续并在神经元内迁移，也能够通过突触连接传播。最著名的是狂犬病病毒(RABV)它从感染的外周部位逆行进入中枢神经系统，在中枢神经系统中复制、扩散、引起神经毒性，如果不及时治疗，会致命(回顾见Dietzschold et al.， 2008)。单纯疱疹病毒(HSV)也通过神经元迁移，在那里它可以复制，并通过这种方式在几个突触连接上传播(Ugolini等人，1989)。当使用这些病毒来标记神经元连接时，由于病毒的持续复制，大部分神经元细胞都被标记了。虽然这可能很有用，但如果标记了太多的神经元，就很难准确地绘制网络连接(Lo & Anderson, 2011)。

在过去的二十年中，一些病毒种类已被改良并用作追踪工具。有工程的RABV和HSV，也有1型伪狂犬病病毒、水疱性口炎病毒(VSV;贝尔等人，2011)，腺病毒,腺相关病毒(AAV)，已被用于追踪和可视化运动、视觉和听觉神经元回路在活的有机体内．的一个变体RABV已经发展到仅通过单个突触步骤标记一个神经元连接，从而阻止了RABV的进一步广泛扩展。这一改进使得哺乳动物大脑中的神经元连接更为清晰(Wickersham et al.， 2007;质粒在Addgene）.

AAV载体:传递神经元示踪剂的平台

AAV载体由于其在大脑研究方面的优势和将遗传物质引入神经元细胞的能力，已经被神经科学家广泛使用了一段时间。AAV基因组是单链DNA分子，AAV载体存在复制缺陷(即它们不能像天然RABV或HSV那样容易在细胞之间传播)。AAV不像慢病毒那样有膜包膜，而是由一个由病毒蛋白VP1、VP2和VP3组成的衣壳所包含。迄今为止，已有数百种变种或血清型被自然发现，或通过基因工程在衣壳蛋白上发现差异。要了解一个简单的概述，请参见Addgene 'sAAV指南．

AAV颗粒相对较小(20 nm)，能够在细胞外空间扩散;它们还具有低免疫原性和细胞毒性。AAV载体可以配备强启动子，以实现高表达和神经元特异性的转基因。金宝搏app下载被广泛用于跟踪和表达Cre-dependent．如果将依赖Cre的载体用于只在特定细胞类型中表达Cre的转基因动物，例如只在多巴胺能神经元中表达Cre，那么神经元追踪还有一个额外的好处，那就是只标记同样表达Cre的受感染细胞子集。AAV载体的另一个优势是，有完善的生产和纯化方案，可产生高滴度(也见AAV方案生产，净化和滴定法Addgene网站)。

表1:常见AAV血清型及其靶组织(改编自Addgene AAV指南）

常用的血清型包括AAV1 - 9，其中大多数血清型能够进入神经元(见表1)(Choi et al.， 2005;Taymans等人，2007年;霍华德等人，2008年;Watakabe等人，2015)。一些AAV血清型的细胞内转运有逆行和顺行的报道，但总体效率较低。并非所有衡量运输效率的方法都是一致的，这可能是由于技术、物种和使用的大脑区域的多样性造成的。已经发现了AAV1， -2， -5， -7， -8 (Taymans等人，2007)，AAV1 (Hollis等人，2008)，AAV6 (Towne等人，2010)，AAV8， -9 (Masamizu等人，2011)的逆行迁移证据;AAV5 (Aschauer et al.， 2013)。AAV1， -5， -8呈顺行转运(McFarland等，2009)，AAV1， -8， -9呈双向转运(Castle等，2014)。AAV血清型之间的差异可能还与细胞对病毒的摄取差异以及病毒生命周期中脱壳步骤有关。

用AAV进行神经元追踪

AAV载体是许多神经科学家的首选，许多组织使用它们来绘制神经元网络。Kohara等人2014用表达crea依赖性荧光标记物的AAV9载体追踪神经元。向只在海马CA2区锥体细胞中表达Cre重组酶的条件突变小鼠大脑注射，可以详细绘制学习和记忆中涉及的神经元回路(Kohara et al.， 2014;质粒在Addgene）.

的加州理工学院的Gradinaru实验室生成了表达几种不同荧光蛋白(红、绿、蓝)之一的新型AAVs (Chan et al.， 2017)。金宝搏app下载如果研究人员将这些不同的AAV载体的混合物注入大脑区域，AAV粒子将以不同的比例感染神经元，使这些神经元发出不同颜色的荧光。根据神经元独特的颜色，我们可以在整个大脑中追踪到单个神经元(质粒在Addgene）.

用AAV载体进行神经元追踪的一个大规模例子是Allen小鼠大脑连接图谱，这是一个绘制小鼠大脑神经元连接的项目。在这个项目中，AAV1被用作一种顺行示踪剂，并在整个小鼠大脑的数百个部位注射。追踪神经元在整个大脑注射部位附近或远端区域表达荧光标记，允许以统一和标准化的方式可视化数量空前的连接，或“连接体”(Oh et al.， 2014)。从这项研究中得到的图像可以在Allen鼠标大脑连接图谱网站．

Janelia校区的研究人员在他们的MouseLight项目中使用了类似的方法，但用AAV2追踪神经元。采用双光子成像技术生成小鼠大脑神经元的三维精细图。MouseLight图像可以在MouseLight网站．

与加州大学伯克利分校的科学家一起，Janelia研究园区还开发了一种新的AAV变体，rAAV2-retro，它的逆行迁移率高于任何其他AAV血清型(Tervo et al.， 2016;质粒在Addgene）.它的效率与传统的染料示踪剂相当，同时与化学示踪剂相比，具有更低的毒性、更高的特异性和更小的技术可变性。rAAV2-retro对肝素的亲和力也较低，这可能解释了为什么它不太可能被隔离在细胞外空间。此外，rAAV2-retro的氨基酸序列改变可能有助于相互作用的摄取或细胞内运输机制。Addgene提供aav2逆转录病毒载体的病毒制备与多种转基因/启动子组合。看看我们逆行AAV博客帖子．

网络可视化的另一个理想特性是能够跨突触传播到后续的神经元。AAV载体不能复制，不能像RABV或HSV一样通过复制传递给后续细胞。然而，一些AAVs的跨突触传播也有报道，尤其是AAV6的逆行传播和AAV2的顺行传播(Salegio et al.， 2013)。Zingg等人2017也提供了AAV1和AAV9能够突触扩散的证据。trans-synaptic贩卖的潜在机制不完全清楚,可能是一种transcytosis AAV粒子在哪里拿起一边的细胞并再次释放另一侧的细胞胞内运输后不引起感染或导致细胞内第一个转基因表达。虽然病毒颗粒在细胞外空间沿轴突长距离扩散的风险总是存在的，但AAV1或AAV9似乎并非如此。值得注意的是，AAV9通过内皮细胞胞吞作用穿过血脑屏障(Foust et al.， 2009;Merkel et al.， 2017)，这两种交通方式可能有共同的机制。像这样罕见的观察可能是AAV载体领域未来发展的起点。

结论

一个理想的神经元追踪和网络识别的综合工具集需要前向和逆行标记、突触限制以及控制单突触和多突触传播。AAV载体涵盖了其中的一些属性，它们的使用使啮齿动物大脑内单个连接网络的可视化成为可能。更好地了解AAV细胞内运输的途径和机制有助于形成更强大的AAV血清型，并可能导致AAV载体的可控跨突触传播。改进的神经元示踪也可以通过使用光遗传学控制的转基因，结合有条件的转基因小鼠，不仅揭示神经元连接的解剖学，而且可视化神经元连接的功能相关，即活动依赖的神经元示踪。除了绘制神经元网络，改进的AAV载体如果能以更小的侵入性到达受影响的大脑部位，也可能是基因治疗领域的有力工具。例如，在神经肌肉疾病中，通过靶向外周结构(如肌肉注射)来实现转基因传递是可取的，而不是直接脑内应用，后者更具侵入性，并发症的风险也高得多。

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