作为我们与宾州向量核，我们将扩大我们对钙感测的工具库存。在此帖子中，我们将查看我们可用的主要类别的传感器。
为什么要监测钙？
监测大脑活动的一种方法是监测钙的动态。在神经元中，钙通道在动作电位时被激活，导致细胞质中钙水平短暂(约100毫秒)增加(称为钙瞬变)(Helmchen等人，1996年；Koester和Sakmann，2000年；Hille，2001）。真核细胞的细胞质中游离钙的浓度约为100nm，并且在动作电位期间上升到微摩尔范围（Wadel等人。，2007年）.因此，钙水平是神经元激活的一个代理(Broussard等人。，2017年）.
使用钙作为神经元活动指标的主要限制是，钙的数量也受其他生物过程的调节，其速率可能因细胞类型而异。因此，根据钙水平推断活性可能变得复杂，具体取决于上下文(巴杜拉等人，2014年）.
单通道钙指示器
单波长传感器基于单波长传感器金宝搏app下载荧光强度随钙结合而变化。这些传感器测量在一个波长,通常把“上/荧光”钙存在和结合检测器时,“关闭”当钙缺失和不绑定到传感器(图1)。基本上,一旦传入大脑,你可以看到这些传感器活跃的神经细胞。当神经元变得不活跃时，钙水平恢复正常，传感器关闭。换句话说，这些传感器是可逆的，这意味着钙可以从它们中分离，使传感器回到关闭状态。
钙从传感器中脱落的速度对于测量不同类型的细胞信号尤为重要。例如，钙水平恢复正常后，对钙亲和力较高的传感器需要较长时间才能关闭。这些传感器不擅长检测频繁事件，但其灵敏度足以检测低水平的钙由少量动作电位产生的钙。
已经开发出具有整体亮度，开/关动力学和钙亲和力差异的单波长传感器，并且基于这些性质，适用于各种应用。这些变体如下所述。
jGCaMP6:
GCaMP指示器是一些最流行的钙传感器（并且经过了各种迭代，直到目前的jGCaMP-X）。GCaMP指标基于修饰的GFP、钙结合蛋白（钙调素、钙调素）和M13肽。结合钙后，CaM发生构象变化，改变GFP生色团，导致GFP亮度增加。因此，GCaMP指示器可用于实时指示钙水平。GCaMP变体具有一系列开/关动力学，可用于测量不同类型的细胞活性。具体而言，最快的变体（GCaMP6f）的Ca值高出2.6倍２＋亲和力（低kd)比慢速变型（GCaMP6s）（表1）。因此，GCaMP6f的上升时间和衰减时间比GCaMP6s快近4倍。GCaMP6s更敏感，99%的时间能够检测到小鼠的单动作电位体内相对于GCaMP6f, GCaMP6f能检测到单一动作电位的概率为84%。
表格1。用于单动势的GCAMP6动力学概述体内，小鼠V1(改编自Chen et al.， 2013)
| 变种 | 改变荧光真实性休息 | 衰变时间（1/2）， 多发性硬化症 | 上升时间(峰）， 多发性硬化症 |
| Gcamp6s. | 23 ± 3.2 % | 550±52. | 179±23. |
| GCaMP6m | 13±0.9％ | 270±23 | 80 ± 7 |
| GCaMP6f | 19±2.8% | 142±11. | 45±4 |
JGCAMP7（即将推出）：
参考：Janelia研究所
可以从jcamp传感器的最新迭代金道格拉斯和珍妮亚研究所。这些GCaMP7传感器对单个动作电位刺激的响应都比GCaMP6的响应更大。单个传感器的优点如下(请参见此处的数据):
- jGCaMP7s-是对动作电位最敏感的反应者（对于单个动作电位，相对于基线荧光，GCaMP7s的亮度约为GCaMP7f变体的两倍，约为GCaMP6s的5倍。）
- jGCaMP7f -是反应最快的变体。
- jGCaMP7b- 展示最亮的休息荧光，可用于成像小神经元过程（树枝状和轴突）。
- jGCaMP7c-在峰值荧光和静息荧光之间表现出高对比度(通过降低传感器静息荧光，同时保持高峰值荧光)，并且由于非活动神经元的背景荧光减弱，有助于在大量密集标记神经元中成像信号活性。这种变体在~100个动作电位后亮度大约增加了12倍。它的亮度是GCaMP7f和GCaMP7s的两倍。
虽然有用，但Gcamp蛋白受到其绿色的限制。它们的激发和发射光谱的波长散射并损坏组织，限制了成像深度体内．为了解决这些限制，开发了基于类似架构的基于红色的钙指标（参见JRCAMP1A，B和JRGECO1A）。
红色指标的一个优点是能够在GFP小鼠系或表达其他基于GFP工具的小鼠中进行多重增殖。在这种情况下，红色指标可以独立于其他基于gfp的工具进行测量。与绿光成像相比，红光成像通常也可以对更深的组织成像，而且可以用更少的激发功率(Rose et al.， 2014)这是因为光散射与波长成反比，波长既适用于激发光，也适用于发射光。
jRCaMP1a, b:
这些是基于mRuby的红钙指示剂。jRCaMP1a和jRCaMP1b的灵敏度低于jGCaMP6，但没有显示出来光电开关之后用蓝光照明(如jRGECO1所做的)。由于一些常见的光遗传学工具(如Channelrhodopsin, ChR2)是由蓝光照射的，因此jRCaMP1a, b对这种光的稳定性使它们适合于钙成像和光遗传学结合的实验。jRCaMP1a和jRCaMP1b也在稍长的(更多的红色)wav下运行长度比jRGECO1a，这使得成像更清晰(参见上面关于散射的注释)。
jRGECO1a:
这是基于Mapple的红色钙指示器，其对JGCAMP6具有可比的敏感性。基于Mapple的GECIS，如R-GECO和R-CAMP 2，当用蓝光照射时，展示照片开关，导致红色荧光的瞬态增加，使其与其使用Optimetics工具（通常由蓝光激活）。
FRET-based钙指标
与单波长传感器不同，烦恼基于钙传感器是基于两个由肽和钙结合域(如CaM或肌钙蛋白)连接的荧光蛋白。金宝搏app下载钙结合使FPs更紧密地结合在一起，提高了两种蛋白质之间的FRET效率。这样，基于fret的钙离子传感器可以通过两个波长(施主发射波长和受主发射波长)进行量化。
Twitch-2b：
Twitch指标包括两个由连接物连接的荧光蛋白(FPs)和肌钙金宝搏app下载蛋白钙结合域(图2)。在没有钙的情况下，Twitch形成一个拉长的结构，其中两个FPs相距更远(~5.2 nm)。当钙离子结合时，FPs移动到一起(~ 15Å)，增加了供体和受体FPs之间的FRET效率。Twitch2B中的供体和受体FPs (mCerulean3和cpVenus)CD分别具有特别明亮的供体发射光谱的优点。
FRET-based钙指标具有比静止时的单波长传感器更亮的优势，允许更好地在细胞中显示(Thestrup等人，2014年），并且已被证明可以检测蜂窝室内的钙（拉塞尔，2011年）.然而，相对于基于fret的指示剂，GCaMP传感器在响应Ca时具有更大的荧光变化的优势２＋绑定（Russell，2011）。例如，在钙结合时，Twitch-2b在受体FP荧光中具有大约2倍的增加（TheStrup等，2014），而JGCamp6传感器显示出约10倍的动态范围（Chen等，2013）．
哎呀，我眨眼了——不可逆钙传感器的好处
当你实时观察大脑时，实时跟踪大脑活动的能力很大。但是，这些实时信号关闭，只能检测到它们的显微镜在它们激活的确切时间（其基本限制在显微镜的场）上，只能检测到它们。基本上，实时传感器具有使大脑活动长期检测的优势，而是仅在小区域中。另一方面，使用不可逆的钙传感器，可以在没有直接监测它的情况下检测整个大脑中的活动，但只有几秒钟。
金巴利:
金巴利:钙调制光激活比率积分器（CaMPARI）不同于可逆钙传感器，因为它可以在用户定义的时间段内永久记录钙的活性。该积分器的工作原理是，只有在同时存在高钙水平和用户提供的紫光的情况下，才能从绿色转换为红色（图3）。这种永久性转换能够在用户指定的时间段内记录大脑广泛区域的钙水平，红色荧光强度与钙浓度相关。CaMPARI通过测量大面积细胞和组织的总钙活性来补充现有的钙指标。
要旨
总的来说，现有的钙指示剂并不缺乏，尽管每种指示剂都有自己的优点和局限性。最好的指标将根据所测量的生物活动的类型而有所不同。
参考文献
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