CRISPR 101:抗CRISPR蛋白关闭CRISPR- cas系统

最初发布于2017年5月23日，最后更新于2020年7月23日，由Jennifer Tsang撰写。

CRISPR-Cas技术在不断发展。Cas蛋白的变异可以用于基因组编辑，激活基因表达，抑制基因表达，及更．但有一样东西被遗漏了:一种关闭Cas活动的方法。令人担心的是，Cas在单元中活跃的时间越长，发生脱靶编辑的机会就越大。尽管使用方法来打开Cas活动光或药物这一领域缺少Cas蛋白的“关闭开关”。

发现抗crispr蛋白

也就是说，直到发现抗crispr蛋白(Bondy-Denomy et al.， 2012)。Anti-CRISPR (Acr)蛋白是噬菌体衍生的CRISPR-Cas系统的小蛋白抑制剂，帮助噬菌体逃避细菌的CRISPR-Cas免疫系统。这些Acr蛋白最初是在I型CRISPR Cas系统．

四年后Sontheimer戴维森实验室发现三反crisprs为II型系统脑膜炎奈瑟氏菌（Nme）（Pawluk等人，2016年）。而化脓链球菌Cas9（SpyCas9）是最常用和研究最充分的CRISPR系统，脑膜炎奈瑟菌也可以用于基因组编辑。在这项研究中，实验室发现抗crispr可以抑制Cas9活性在HEK293中，通过减少编辑从控制样本的~30%到Acr样本的0-10%。Acr蛋白也可用于阻止dCas9与DNA的连接。

自从这些早期的抗CRISPR研究以来，科学家们发现50多种抗CRISPR蛋白与CRISPR Cas系统交互，如cas3, Cas9, Cas12和Cas13(Marino et al.， 2020)。一些Acr蛋白是特定于特定Cas蛋白的，而另一些可以抑制来自多种细菌的CRISPR酶。

关于抗CRISPR命名法的一点注记

Acr家族蛋白命名为它们阻塞的CRISPR Cas系统类型，并按发现顺序编号(Bondy-Denomy et al.， 2018)。例如，上面提到的AcrIIA4表明，它是发现的第四个阻断II-A CRISPR-Cas系统的Acr蛋白。由它们所阻断的CRISPR-Cas系统类型组织的Acr蛋白的完整列表可以在这里找到．

抗CRISPR蛋白是如何工作的？

抗CRISPR蛋白具有高度多样性，但大多数通过以下三种方式之一阻断CRISPR活性：

1. 抑制DNA结合
   示例：AcrIIA4阻止Cas9与PAM站点的交互(Dong et al.， 2017)，和AcrIIC3导致Cas蛋白二聚化阻止PAM识别位点(哈林顿等人，2017)。
2. 抑制crRNA负载
   示例：AcrIIC2与Cas9的相互作用干扰和阻止crRNA-Cas复合物的正确组装(朱等人，2019)。
3. 抑制DNA切割
   示例：AcrIIC1与Cas9的HNH核酸内切酶结构域结合并防止靶DNA切割（Harrington等人，2017年）。

图1:抗CRISPR蛋白(Acr’s)可以通过多种方式阻断CRISPR活性，如抑制crRNA装载，抑制DNA结合，或抑制DNA切割。

在你的实验中五种抗CRISPR蛋白的方法

1.减少非目标效应

长时间的Cas活动会增加非目标编辑的机会，尤其是在大多数目标编辑发生后。抗CRISPR蛋白可用于限制这种非靶点编辑，但何时是关闭Cas活性的最佳时间？通过缓蚀剂定时实验，得出Doudna实验室发现至少50%的目标Cas9编辑发生在前六个小时内。在引入Cas9 RNPs六小时后加入人类细胞时，AcrIIA4减少了脱靶编辑，但仍然允许对靶编辑（Shin等人，2017年）。

Acrs还可用于减少脱靶编辑基本编辑，它将一个核苷酸碱基对转换成另一个碱基对在一个特定的位置。

2.对CRISPR活动的时间、空间或条件控制

通过诱导启动子、光或小分子调控Acr蛋白可以实现对CRISPR-Cas活性的快速、动态和空间控制。例如,融合AcrA4II到光敏的LOV2结构域允许反crispr活动由蓝光控制(Bubeck et al.， 2018)。

三。降低CRISPR在组织中的细胞毒性

Acr蛋白的体积较小(约50-200个氨基酸)意味着它们可以被输送在活的有机体内使用AAV载体。有办法关闭CRISPR-Cas系统防止靶向效应和细胞毒性这是由于组织中核酸酶活性过高所致(Li et al.， 2018)。

4.在设计病毒时选择标记

Acr基因可作为工程病毒的阳性选择标记。例如，一个Acr基因被用来取代难以工程的Sulfolobus islandicus杆状病毒的基因（Mayo Muñoz等人，2018年）。只有基因缺失的病毒颗粒在受到病毒攻击时才能复制美国islandicusCRISPR-Cas系统。

5噬菌体疗法

噬菌体疗法使用噬菌体来治疗细菌感染，作为抗生素的替代品。但由于许多细菌病原体拥有CRISPR-Cas系统，噬菌体治疗可能不会那么有效。这就是Acr蛋白的作用。Acr蛋白足够小，可以被设计成“盔甲”治疗性噬菌体，以保护它们免受致病菌CRISPR-Cas系统的伤害。

结论

CRISPR是一种进行基因组编辑的好方法。但是，同样重要的是翻转开关并关闭CRISPR活动的方法。关闭CRISPR活性的能力是实现基于CRISPR的治疗和在实验室进行更精确编辑的重要一步。

参考资料和资源

工具书类

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