光遗传学+ CRISPR，利用光来控制基因组编辑

最初于2016年3月8日发布，最后由Nyla Naim于2020年9月3日更新。

自2012年CRISPR技术首次应用于基因组工程以来，世界各地的科学家一直在对其进行重大改进。许多这些进展都源于减少脱靶Cas9活性的目标。nickase、prime编辑、抗crispr蛋白和其他技术的使用都旨在提高靶向特异性或减少Cas9活性持续时间。

光遗传学领域以实现精确的时间和空间控制而闻名。光遗传学利用基因编码工具，如微生物视蛋白，利用光来控制细胞活动。2015年，科学家将CRISPR和光基因技术结合起来，开发出了各种光激活CRISPR工具。这些工具允许科学家利用光线从外部控制基因组编辑过程的位置、时间和可逆性。继续往下读，了解研究人员可用的各种光控CRISPR工具，其中一些很容易在Addgene找到。

利用dCas9照射转录激活

2015年初发布的最初的光激活CRISPR系统专注于利用光来控制转录。两个独立的实验室,Moritoshi佐藤的实验室在东京大学和查尔斯Gersbach的实验室杜克大学基于光诱导异质二聚隐花色素2 (CRY2)和钙和整合素结合蛋白1 (CIB1)蛋白开发了类似的系统。两组研究人员的目标都是创造一种系统，在给予sp的同时，利用光来开启和关闭基因表达时序控制、可逆性和重复性。

的SATA实验室开发的系统由两种融合蛋白组成:1)基因组锚点——与CIB1融合的非活性、死亡Cas9蛋白(dCas9);2) CRY2光解酶同源区(CRY2PHR)融合到转录激活域(VP64或p65)。dCas9-CIB1融合蛋白在细胞内表达后，在引导RNA (gRNA)的指导下与目标DNA序列结合，而cry2fr -activator融合蛋白自由漂浮，如下图所示。一旦被蓝光触发，CRY2和CIB1蛋白异二聚，并将激活因子移动到相应位置激活基因转录。研究人员测试了多种组合，以优化两种融合蛋白。最佳组合为NLS-dCas9-trCIB1和nlsx3 - cryfr -p65，暗态下本底活性最低，31X时倍诱导最高。通过在蓝光照射(470nm)期间使用狭缝模式，研究人员表明，人类ASCL1基因的表达可以以可逆和可重复的方式进行空间控制。

与他们的光激活CRISPR/Cas9效应器(LACE)系统在美国，Gersbach实验室利用了类似的策略，开发了优化的光激活CRISPR基因激活系统，但选择了不同的最佳融合蛋白组合。优化后的系统包括:1)CIBN-dCas9-CIBN，其中CIBN为CIB1的N端片段，融合到dCas9的N端和c端;2) CRY2FL-VP64，全长CRY2与VP64转录激活域的融合。使用该系统在HEK293T细胞中诱导人IL1RN的表达，研究人员发现2小时后mRNA水平增加了11倍，30小时后增加了400倍。当蓝光(450nm)循环时，该系统也被证明是可逆的和可重复的。利用裂隙掩模，研究人员还证明了空间控制基因表达的能力。

这两种技术都利用光诱导二聚来激活CRISPR系统。这种常见的光遗传技术可以应用于其他需要光来重建酶活性的分裂系统。

使用分割系统的NHEJ和HDR由NHEJ和HDR的可光激活基因组修改

2015年晚些时候，佐藤实验室推出了一款用于切割目标DNA序列的光激活系统(Nihongaki, et al.， 2015)导致双链断裂(DSB)，可以通过任一非同源端连接修复(NHEJ.)或同源定向修复(HDR）.该系统的独特之处在于它利用了一个“分裂”核酸酶——作者将Cas9分为n端(残基2-713,N713)和c端(残基714-1368,C714)两半，使Cas9在分裂时失去功能，但在两半重新结合时恢复功能。通过将一个光诱导异质二聚结构域融合到每个Cas9片段上，作者创建了一个光活性Cas9工具，如下图所示。利用了他们最成功的设计磁铁照片开启蛋白质来源于真菌光受体Vivid (VVD, N. crassa) (Kawano et al.， 2015)。绰号paCas9-1，由融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714组成，该新系统具有低本底和高倍Cas9活性诱导(16.4倍)。该paCas9-1光诱导系统能够识别相同的PAM，具有与全长Cas9 (flCas9)相似的靶向特异性。当蓝光(470nm)触发时，paCas9-1通过NHEJ诱导indel突变(频率为20.5%)，通过HDR诱导indel修饰(频率为7.2%)。

作者还表明，他们可以通过使用nMagC714而不是nMagHigh1-C714来修改paCas9-1，从而降低系统的本底活性，生成paCas9-2。此更改没有显著改变系统em产生突变的效率，当激活光和降低的背景dsb(无法检测)。和他们之前的工作一样，佐藤实验室还表明，paCas9-2系统可以通过打开和关闭蓝光来进行空间控制和可逆激活。

正如人们可能从Cas9的模块化特性中所期待的那样，Nihongaki等人证明了在它们的分裂融合中交换Cas9域并产生光激活的可能性nickase和一个可光激活的抑制因子(dCas9)。所有变异株的活性都是可逆的和可重复的。

自从这些最初的研究在2015年发表以来，更多的分裂系统被开发出来用于基于crispr的基因编辑(见下表)。例如,far red light-activated split-Cas9 (FAST)系统组成型表达Cas9的c端片段，而n端转录依赖于光(Yu et al.， 2020)。为了表达N-Cas9，叶海峰的实验室使用了细菌光敏色素BphS，该BphS在远红光(730 nm)下产生c-di-GMP。这个核苷酸触发了BldD蛋白到细胞核的易位。为了将这种依赖光的活性与转录结合，他们将BldD与转录激活因子p65和VP64融合，后者反过来转录N-Cas9。N-和C-Cas9片段然后二聚形成一个功能蛋白，由于分别与高亲和力相互作用的蛋白Coh2和DocS融合。

由于蓝光在体内的应用有限，因此远红外的使用特别有趣。紫外线和蓝光容易被皮肤吸收和散射，因此无法到达更深的组织。此外，高强度的暴露会导致DNA损伤。然而，远红光可以穿透皮肤表面5毫米，光毒性较小。利用FAST系统，叶的实验室可以使用编码FAST结构的微型圆DNA载体在小鼠中编辑tdTomato荧光报告基因。这个概念验证模型为动物模型中基于crispr的系统的光遗传操作打开了有趣的可能性。

使用反crisprs来关闭基因组编辑

单链Cas9光电开关

CAS9的光激活也可以使用单链融合蛋白来实现通过将CAS9融合到光感受器来实现。一个主要例子来自实验室迈克尔•林，他开发了一种由Cas9和可光解的二聚体绿色荧光蛋白组成的嵌合蛋白(pdDronpa)(周等人，2018)。pdDronpa二聚体在青色光(500nm)下解离。通过将两个pdDronpa结构域融合到Cas9的DNA结合裂隙两侧的位点上，荧光结构域二聚并阻止DNA在黑暗中结合。在光刺激下，pdDronpa部分分离，允许DNA结合和裂解。这种技术被应用于创作可光开关spCas9、dCas9和金黄色葡萄球菌Cas9 (saCas9)蛋白质，显示了这种方法的多功能性。这项研究产生了首个具有光学活性的saCas9蛋白。

别光!光活性抗crisprs抑制Cas9活性

反crispr蛋白是一组高度多样化的蛋白质，能够阻止CRISPR-Cas系统。它们已被用于阻止基因组编辑，减少脱靶活性，并防止细胞毒性作用。想了解更多细节，请查看我们的博客:抗crispr蛋白关闭CRISPR-Cas系统．

请听反crispr播客部分

仅仅表达抗crispr蛋白并不能控制Cas9活性何时被阻断。因此，采用光遗传技术可以更精确地控制Cas9的活性。Dominik Niopek的实验室实现这一点,将抗crispr的Acr蛋白(acria4)融合到一个光敏的LOV2结构域来自A. sativa (Bubeck et al.， 2018)。LOV2有一个c端螺旋，在蓝光刺激下会展开。当熔合到吖啶醇的催化位点时，这种展开构象的转移会干扰活性。由此产生的系统被命名为CRISPR-Cas9活性切换，通过一种新的光遗传变体acia4 (卡萨诺瓦）.如下图所示，在无光条件下，Cas9被acia4束缚，呈现非活性。在蓝光存在下，LOV的展开抑制了AcrIIA4，允许Cas9的释放。

CASANOVA系统的一个值得注意的应用是它在光介导CRISPR标记研究染色质结构(霍夫曼等人，2020年)。荧光dCas9蛋白可用于识别特定基因组位点的成像技术。由于dCas9的表达可能会改变基因组和染色质结构，因此调节dCas9结合发生的时间是有用的。Bubeck等人在U2OS细胞中表达了一种靶向端粒的gRNA和一种带有三种红色荧光标记的dCas9融合蛋白。光激活后，dCas9在几分钟内释放，20-40分钟后形成红色病灶。CASANOVA系统是多功能的，因为它可以适应调节基因编辑，打开转录，标记染色质，和研究动力学。

用化学方法将CRISPRs光笼起来

上述技术均采用了光活性策略由自然产生的光活性蛋白(如CRY2和Vivid)改造而成的——另一方面，Alexander deiter的实验室采取了不同的方法。这些研究人员使用了基因编码photocaging技术插入轻型可拆卸保护组，具体为硝基苄基光笼赖氨酸(PCK)，在Cas9蛋白上（Hemphill et al.， 2015)．为了将PCK插入Cas9的特定位置，该小组使用了一个工程吡咯基tRNA/tRNA合成酶对当到达琥珀终止密码子TAG时加入PCK。(为了了解更多使用吡咯酰tRNA合成酶的氨基酸位点特异性结合，读这篇文章）.

研究小组首先对Cas9中的各种赖氨酸进行了光笼化测试，以确定哪种赖氨酸能最好地抑制蛋白切割目标DNA的能力，最后对K866赖氨酸进行了光笼化，如下图所示．接下来，Hemphill等人通过双报告荧光分析证明，Cas9 K866PCK突变体在紫外光(365nm)照射前确实不活跃，而在紫外光照射后，它显示出与野生型Cas9相似的裂解活性。当使用掩模技术时，这种光笼技术也显示了对Cas9裂解的空间控制。最后，Hemphill等人提供的数据显示，这种基因编码的光笼Cas9系统可以沉默内源性基因的表达，表明光诱导沉默了HeLa细胞中的转铁蛋白受体CD71。

光激活CRISPR策略的比较

要了解更多细节，请查看这个光基因CRISPR技术的比较综述(Matony et al.， 2020)。无论你是想激活、抑制还是修改一个基因，你现在都可以使用光来控制你的基因组编辑。随着CRISPR和光遗传学的不断发展，我们期待着更多的工具，迫不及待地想看看你在未来将它们用于什么酷应用!

参考

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额外的资源

• 杰夫·阿克斯特(jeff Akst on)的《光遗传学与CRISPR的相遇》(Optogenetics Meets CRISPR)这位科学家
• “Photoactivatable # CRISPR-Cas9系统!道格·莫洛克继续著一个CRISPR博客

参考资料在Addgene博客188博金宝官网

• 阅读其他光遗传学的博客文章
• 阅读我们的引物在光遗传学德里克·p·西蒙
• 阅读我们的采访Ed Boyden

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