抗体101:免疫荧光入门

免疫荧光(IF)是一种揭示细胞世界的免疫分析方法。这项技术可以让你问这样的问题:“我感兴趣的蛋白质在细胞中的什么位置?”“这种疾病会改变我细胞的结构吗?”或者“这种突变如何影响我组织中发现的细胞类型?”它的原理和其他基于抗体的检测是一样的，比如ELISA或西方墨点法，但它可以让你在一个完整的细胞、组织，或在某些情况下，一个完整的有机体中看到感兴趣的目标。但是，与任何基于抗体的技术一样，验证和适当的实验设计是必不可少的。在本文中，我们将介绍在计划和执行IF实验时需要考虑的一些最重要的事项。

免疫荧光法是什么?

一般来说，IF是一种应用，在这种应用中，与荧光分子结合的抗体被应用到细胞或组织样本上，并与它们的目标(通常是蛋白质)结合。然后你可以使用荧光显微镜来寻找那些荧光分子，知道你看到荧光的地方表明你的目标的位置。与IF相关的其他术语还有免疫细胞化学(ICC)或免疫组化(IHC)。这三个术语都是指使用抗体在完整样本中可视化目标，ICC是细胞，IHC是组织。当我们用荧光来观察抗体时，IF特别被使用(关于荧光的一些背景，请尝试荧光显微学简介视频iBiology)．免疫组化和ICC本质上只是更一般的术语，也可以指使用非荧光可视化方法的检测。请继续关注未来的博客文章，学习更多关于这些技术的知识!

直接免疫荧光与间接免疫荧光

当谈论IF时，有几种不同的方法需要熟悉，直接的和间接的。对于直接IF，研究人员使用单一抗体来形象化他们的目标。这些抗体是针对特定的抗原产生的，然后与荧光分子结合，让一个人“直接”看到他们的目标。相反，间接IF需要两种抗体:一种是一种抗体，另一种是二种抗体。对于间接IF，一抗针对感兴趣的抗原，但不与荧光分子相连，相反，针对一抗的二抗与荧光团结合(图1)。

图1:直接免疫荧光和间接免疫荧光工作方式的比较。图像创建BioRender.com

间接IF是一种比直接IF更常见的方法，所以我们在这里将重点讨论这种技术。间接IF更为常见的原因之一是二抗通常是多克隆的，这意味着多个二抗分子可以与单个一抗结合，导致信号放大。另一个原因是成本效益。产生和验证一抗是一个耗时和昂贵的过程。考虑到可能存在的大量一抗，你可以开始看到为什么为每个一抗生成荧光团偶联版本可能无法控制。相反，更有效的方法是产生少量针对普通igg的二抗，然后将它们与一组荧光团结合。实验室通常会保留一些可信赖的二抗，与更多的一抗进行混合和匹配。这种策略使您能够灵活地瞄准不同种类的原色，并给目标标上不同的颜色。

多重免疫荧光

说到不同的颜色，有几种不同种类和颜色的二抗可以很容易地执行多路IF。通过在单个样本上使用不同种类的多种一抗，然后可以使用与不同荧光团结合的相应的二抗来一次可视化多个目标。多路复用的一个优点是，你可以问同一个样品中的多个蛋白质是如何相互关联的。为了使这一策略发挥作用，重要的是要确保你使用的是激发/发射光谱不重叠的荧光团的二级荧光体。多路IF还需要一些额外的优化，因为每个抗体的性能不同，一些抗体会影响其他抗体的性能。但是，一旦你找到了正确的协议，多重IF可以给你带来影响和美丽的结果。

进行免疫荧光实验

执行IF的过程可以大致分为以下和图2中列出的几个步骤。要更深入地了解这些步骤和技术，请参见2019年．

1. 固定

• 良好的固定能保持样品形态，对目标表位的影响最小。
• 固定样品有多种方法，每种方法都有其优缺点。
• 使用的方法取决于目标和样本类型。

2. 样品制备

• 这个步骤可以包括多个更小的步骤，所有这些步骤都有助于确保抗体能够接近它们的目标，最终能够对它们进行成像。
• 同样，所使用的方法取决于目标和样本类型。
• 示例步骤包括:渗透、抗原提取和切片。

3. 阻塞

• 阻断用于减少抗体的非特异性结合。
• 您可能需要根据您的目标和样品类型优化所使用的块类型、浓度或孵育时间。

4. 主要的抗体

• 这是你的样本上的第一个抗体，它会与你的目标分子结合。
• 您可能需要优化浓度和培养时间。

5. 二次抗体

• 不出所料，这是你应用的第二个抗体，它与第一个抗体结合并与一个荧光团结合。
• 您可能还需要优化此步骤的浓度和孵育时间。

6. 保存和成像

• 与样品制备类似，这一步可能涉及多个更小的步骤，但目的是保存样品的完整性和荧光，并捕捉结果。
• 使用的方法取决于样本类型，显微镜检查工具，以及你的实验目标。
• 示例步骤包括:反染色、在载玻片上安装样品和共聚焦

图2:间接免疫荧光法的高级概述，以及每一步的关键考虑。图像创建BioRender.com

前两个步骤不是IF所独有的初步步骤，但它们会对IF实验的结果产生重大影响。每个步骤的许多细节取决于你的抗体、目标抗原表位和样本类型(2019年)．为了缩小使用的具体方法的范围，首先阅读那些成功使用了你的特定抗体的论文中的方法部分，并参考生产商的建议。

当你优化你的方案，总是记得包括控制显示你的抗体是特异性结合。对于阳性对照，目的是使用已知表达目标或被操纵过表达目标的样本。对于阴性对照，使用已知靶标自然缺失或已被敲除/敲除的样品。“无初级”、预吸收和同型控制也常用于IF实验。确切地说，您所执行的控制将取决于您的实验环境。

为化验选择抗体

您为实验选择的抗体将对您使用的方案和实验的最终结果产生重大影响。那么如何选择好的呢?选择一个辅助程序通常比选择一个主程序要简单得多，所以我们从这里开始。一些最重要的考虑是确保你的二级1)将识别您的主要抗体的种类和2)是共轭荧光团,适合您的实验(即光谱匹配您的光谱成像仪器和可用属性不重叠与其他荧光分子你的样品)。

当选择一抗时，首先，记住抗体识别非常特定的三维表位。不同的样本处理步骤可以以不同的方式改变抗原表位，因此在一种情况下有效的抗体可能在另一种情况下不起作用。尽量选择在IF、IHC或ICC中验证过的一抗。最大的区别如果和ICC /包含IHC您使用与二次抗体的类型,只要样品处理步骤中使用荧光包含IHC / ICC分析类似于你计划使用的,那么主要的抗体可能都按预期执行。

如何找到有效的抗体?许多生产和分发抗体的公司在各种应用中验证它们，包括IF(或IHC或ICC)，并将分享他们的一些结果和相应的协议。其他研究人员也可能在IF中测试了一种抗体，并将通过他们的出版物或公司网站上的评论分享他们的发现。为了确定抗体看起来有多可靠，以及你需要使用什么样的治疗方案，重要的是回顾你考虑的每个抗体可用的数据和方案。(想了解更多关于抗体验证的知识，请点击Uhlen等，2016是一个很好的开始。)

检查现有的抗体似乎是压倒性的，特别是当有几十种产品都声称针对你感兴趣的蛋白质。值得庆幸的是，有很多网站汇编抗体数据，可以帮助你比较来自不同公司的抗体，比如验证抗体数据库和CiteAb．你选择的抗体可以成就你的实验，也可以毁掉你的实验，所以要利用所有可用的资源，给自己时间仔细检查你的选择。如果可能，尝试选择一些抗体，似乎有希望比较在你自己的实验室。

即使有了所有可用的资源，仍然很难找到一种你有信心的抗体，特别是如果你工作的生物体在生物医学研究社区中代表性不足。你可能要冒一些抗体的风险。一旦你的实验室里有了抗体，无论它们有多“危险”，验证它们在你手上和你的特定实验中的表现总是很重要的。如果您确定了一种抗体，它在给定的环境中表现非常好或很差，请让您的社区知道!分享你的经验，不管是积极的还是消极的，将有助于使抗体在未来更加有效和可靠。

我们希望这篇文章对免疫荧光有所帮助。该技术不仅可以为您提供最紧迫的研究问题的答案，而且还可以提供令人惊叹的图像(我是唯一一个与IF结果作为艺术作品在家里?)花点时间去研究抗体、协议和适当的控制，你就能很好地完成一个成功的IF实验。

引用和资源

参考文献

Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH(2018)免疫荧光染色技术简介。发表于:分子生物学中的方法。施普林格纽约，299-311页。https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8935-5_26

(2012)荧光显微镜技术。iBiology。https://www.ibiology.org/talks/fluorescence-microscopy/

Uhlen M, Bandrowski A, Carr S, Edwards A, Ellenberg J, Lundberg E, Rimm DL, Rodriguez H, Hiltke T, Snyder M, Yamamoto T(2016)抗体验证方案。Nat方法13:823 - 827。https://doi.org/10.1038/nmeth.3995

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