绝大多数细菌是未驯化的，这限制了科学家研究它们的工具。例如，基因敲除CRISPR干扰(CRISPRi)仅限于实验室适应的细菌，因为将CRISPRi机器引入不同的细菌物种一直是一个挑战。现有的协议可以将CRISPRi转移到单个细菌菌株中，例如枯草杆菌,或者是一个狭窄的细菌种类范围，比如人体肠道细菌多形拟杆菌,分枝杆菌,假单胞菌,大肠杆菌. 然而，许多非模式细菌物种缺乏遗传工具。
移动CRISPRi来自美国的实验室杰森·彼得斯,奥伦·罗森伯格,卡罗总提供了一套精简的工具，用于在许多类型的细菌中使用CRISPRi:实验室适应的，环境隔离的，和疾病相关的。
移动CRISPRi：CRISPRi传输的模块化方法
Mobile-CRISPRi相对于现有的细菌CRISPRi方法有两个优势。首先，它的模块化设计允许定制菌株特异性启动子、抗生素抗性选择标记、grna和dCas9蛋白。第二，它可以被引入到更广泛的细菌中。一旦转移，Mobile-CRISPRi稳定地整合到基因组中，并在正常的DNA复制和细胞分裂期间进行繁殖。Mobile-CRISPRi不破坏基因功能，并且在超过50代的时间内保持稳定和活跃。
两种通过细菌结合引入移动CRISPRi的方法
对于革兰氏阴性菌，Mobile-CRISPRi是利用细菌引入的Tn7转座子系统．该系统由两部分组成:表达Tn7转位基因的质粒(tnsA,tnsB,跨国公司,tnsD,tnsE)，质粒中含有含有左右Tn7端序列的Mobile CRISPRi盒。带有RP4转移机制染色体拷贝的供体细菌在三亲本交配方案中调动这些质粒转移到受体细胞。Mobile-CRISPRi整合高度保守的谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶下游(glmS)由于TnsD（一种序列特异性DNA结合蛋白）的位点选择，受体细菌中的基因。选择去除缺乏Mobile CRISPRi完整染色体拷贝的供体细菌和受体细菌。
对于厚壁菌革兰氏阳性细菌，使用细菌的结合和结合元素枯草芽孢杆菌(ICEBs1)系统. ICES1携带接合所需的基因，但也可以携带货物基因，如Mobile CRISPRi。移动CRISPRi冰元件首先被引入到B．枯草杆菌基因组然后，移动CRISPRi从枯草杆菌对感兴趣的细菌紧随其后IPTG诱导接合基因和双亲交配。从心脏切除后枯草杆菌在基因组中，可移动的CRISPRi ICE元件形成一个接合质粒状DNA环，并转移到受体细菌中，在那里它整合到细胞中trnS-leu2发生地
该团队表明，Mobile-CRISPRi可转移到多种细菌物种，包括与人类疾病有关的几种。然而，转移的速率是可变的。他们通过比较在选择性培养皿上生长的菌落数量和在非选择性培养皿上生长的菌落数量来测量迁移速率。大多数细菌在每100 ~ 1000个菌落中有1个转移，但有些细菌，包括粪大肠杆菌和奇异芽胞杆菌，每100万个殖民地只有1次转移。更高的传输速率更适合于全基因组CRISPRi文库筛选实验其中保持文库多样性很重要，而较低的转移率仅适用于单基因敲除实验。
移动CRISPRi应用程序
Mobile-CRISPRi将CRISPRi扩展到非模型细菌，包括致病性菌株和环境分离物。例如，Peters和他的同事使用Mobile-CRISPRi基因敲除了几种与人类疾病相关的细菌的个体基因(金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌)除…之外维奇里奥·凯西，从奶酪中分离出来的细菌。通过组成性表达RFP报告基因的敲除测定的敲除效率在不同的细菌菌株中是可变的，从~8到150倍不等，所有测定的物种的中位敲除率为~40倍。
除了了解细菌的基本生物学，Mobile-CRISPRi还可以用来识别抗生素耐药性基因。作为抗生素靶标的基因往往是必需基因，这给研究抗生素带来了挑战，因为完全击倒是致命的。然而，不完全或可滴定的基因敲除可以保持细菌存活，并允许研究人员研究该基因是否是抗生素的靶点。例如，让我们来看看基本基因folA它编码抗生素甲氧苄啶的靶点。什么时候产气肠杆菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌（所有机会性病原体）在甲氧苄啶存在下生长，培养物经afolA与对照gRNA处理或未处理细菌相比，gRNA对甲氧苄啶更敏感。有folA基因产物不是甲氧苄啶的靶标，敏感性不会改变。
汇集击倒Mobile-CRISPRi也有可能。作为原理的证明，Peters和他的同事构建了一个40人的文库，目标是20个肠杆菌属下水道，一种属于正常人类肠道菌群的细菌。指南针对必需和非必需基因，每个基因有两个指南。该文库在含有100倍过量野生型细菌的葡萄糖最低培养基中生长，并在有或无CRISPRi敲除诱导的6代和12代后测量40个文库菌株的相对频率。正如预期的那样，表达以必需基因为目标的导向物的细菌较少，而含有以非必需基因为目标的导向物的细菌保持不变，在12倍比6倍时适应性效应更为显著。
移动CRISPRi的主要收获
Mobile-CRISPRi可用于非模型细菌物种，其模块化性质允许定制向导、启动子、选择标记和不同版本的dCas9。整合后，Mobile-CRISPRi不需要选择就能稳定表达，可滴定敲除允许研究基本基因，如与抗生素耐药性有关的基因。你准备好将Mobile-CRISPRi移动到你感兴趣的细菌中了吗?找到Mobile-CRISPRi质粒在Addgene！
参考文献
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