CRISPR汇聚库必须使科学家能够轻松地进行全基因组屏幕，有效地调查基因功能。CRISPR库可用于通过特定sgRNAs与Cas9或Cas9衍生物合并以敲除，抑制或活化靶基因。
未改性Cas9导致双链DNA断裂中通常导致功能的完全丧失，而核酸酶失活Cas9（dCas9）可以被拴在阻遏（CRISPRi）或激活结构域（CRISPRa）来调节基因表达。有些CRISPR库包含每个基因许多sgRNAs增加遗传屏幕的信心。不过，也有以利用每个基因只有少数sgRNAs优化库的好处。这些库提供更多的信息，同时使用更少的资源和是特别有用的努力筛选等原代细胞或细胞的数量有限时在活的有机体内．
最近，实验室大卫根和约翰DoenchBroad研究院已经开发完成这些任务的人类全基因组CRISPRko（淘汰），CRISPRi（干扰），和CRISRPa（激活）库（Doench等人，2016年那桑森等人，2018年）.这些库利用了基于中确定的规则而设计的优化的sgrnaDoench et al.， 2014预测因组活动。在这项研究中科学家观察约1 900 sgRNAs鉴定序列特征和改进因组活动，因此库性能调整。根和Doench实验室的优化，全基因组CRISPRko，CRISPRi和CRISPRa库已经证明优于其他流行的CRISPR库（见下文）。
让我们来看看优化后的人类CRISPR库的特点和优势。
布鲁内洛：人类CRISPRko因组文库
Brunello文库由77441个sgrna组成，平均每个基因有4个sgrna和1000个非编码对照sgrna。该文库旨在提高人类基因组的靶上活性，同时减少脱靶效应(Doench等人，2016年）.为了测试库中，他们进行了全基因组的阴性选择屏幕与两个A375（黑素瘤）和AT29（结肠癌）细胞，并通过金标准组基因的耗尽评估文库的性能（1580必需和927的非必需基因）.根和Doench实验室开发因组级别的指标来评估生存能力的屏幕库的性能。基于这些指标的布鲁内洛库比在必需基因的枯竭等热门CRISPR库更有效。在sgRNAs的二次取样分析，布鲁即使只有一个因组优于另一个CRISPR库6个sgRNAS，突出CRISPR库因组设计的好处。因此，布鲁库证明几个优化sgRNAs是足够用于有效库的性能，用于探测细胞的有限数量的重要标准。
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多尔切托：人类CRISPRi因组文库
虽然CRISPRko文库在基因筛选中识别强攻击非常有效，但它们也有一些局限性。CRISPRko导致功能完全丧失，这意味着如果一个必需基因在预期的筛选表型中发挥作用，它可能会被错过，因为它对生存能力至关重要。此外，高拷贝数基因可能模仿生存能力基因，因为它们容易受到可导致细胞死亡的dsDNA断裂的增加。因此，CRISPR抑制(CRISPRi)文库提供了一种筛选功能表型缺失的替代方法，同时避开了这些问题。
CRISPRi库利用经工程改造的Cas9，其中包含在核酸酶结构域的多个点突变。这些突变导致在非激活RNA引导的DNA结合蛋白（dCas9）。然后dCas9被拴在压制性域，如KRAB，以防止有效的转录从因组目标。CRISPRi是有效的周围转录起始位点（TSS）的狭窄范围内。根和Doench实验室选择sgRNAs在这个最佳窗口和排名根据它们的优化因组规则和潜在的脱靶效应。该多尔切托库包含两套sgRNAs的;A，前3排sgRNAs，和B，接下来的3排sgRNAs。多尔切托能够同时减轻由高拷贝数的dsDNA切割诱导的毒性非必要和必需基因之间进行区分类似于布鲁敲除文库。仅含有3 sgRNAs（组A）也优于CRISPRi库与在因组度量10个sgRNAs甲多尔切托库，再次确认因组设计在库效率显著作用。
卡拉布雷斯:人类CRISPRa sgRNA文库
除了抑制基因表达，dCas9还可用于转录激活。特定基因的激活使科学家能够进行全基因组的功能筛选。这些筛选可以帮助揭示低表达基因的功能，或受基因激活而非耗尽影响更大的基因的功能。目前已经开发了多种策略来招募转录机制到dCas9及其RNA定向结合位点。这些方法包括将激活域(如VP16)融合到dCas9或招募多个VP16副本，称为“Sun Tag”方法(Tanenbaum等人，2014年）.的因组或tracrRNA序列也可以修改以包括额外招募转录因子RNA域。
Root和Doench实验室利用带有两个PP7茎环的tracrnas，将额外的转录因子招募到目标区域(Sanson et al.， 2018)。将该tracrRNA与sgRNA表达载体结合，仅用两个结构体(另一个包含dCas9-VP16）.和CRISPRi一样，CRISPRa只有在sgrna以基因上的特定位置为靶点时才有效。对于CRISPRa, sgrna靶向于TSS上游150-75个核苷酸之间。与Brunello和Dolcetto库相似，sgRNA是根据先前建立的sgRNA规则和潜在的靶上和靶外效应来选择和排名的。每个基因选择了6个最好的sgrna，并分为两组，A和b。Sanson等人证明了Calabrese文库实际上比该文库识别了更多的hits山姆库的方法在A375细胞中筛选vemurafenib耐药的比较研究中。SAM系统(CRISPR/Cas9协同激活介质)使用改进的激活剂设计，由非活性Cas9- vp64、带有两个MS2 RNA适配体的sgRNA和MS2- p65 - hsf1辅助蛋白(Konermann等人，2015年）.
Root和Doench还比较了Calabrese文库和开放阅读框(ORF)过表达文库对MEK抑制的抗性。虽然Calabrese和ORF过表达文库都鉴定出了几个重叠的基因，但大多数基因在单个文库中是独一无二的。这些独特的命中可能在其他筛选中为假阴性，这意味着ORF和CRISPRa文库可以用于基因功能的补体研究。
作为根和Doench CRISPR库的应用程序
总的来说，Root和Doench实验室已经证明了他们优化的、人类全基因组CRISPRko、CRISPRi和CRISPRa文库在使用更少的sgrna的情况下对探索基因功能非常有效。这些新的紧凑的文库将允许科学家在标准培养的细胞以及更困难的条件下(如模型系统和原代细胞)进行全基因组筛选。
参考文献
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