西方的屁股。elisa。免疫荧光。这些技术有什么共同之处?它们通常都需要二次抗体，通常是小鼠或兔的抗体。虽然抗体肯定没有被“破坏”，但它们的产生确实需要持续的动物牺牲。有没有免疫检测的替代方法?进入Gorlich实验室以及他们的抗小鼠和兔IgG次级纳米体工具箱。纳米体就像微小的抗体，与上面列出的所有分子技术的抗体相比，即使不是更好，也同样有效，但它们也可以在细菌中表达，并用常用的蛋白质纯化方法提取。继续读下去，了解更多关于纳米体的知识，以及它们的结构和功能如何与IgG抗体相比较，以及如何在你的实验室中生产它们。
结构的比较
顾名思义，纳米体是更小的抗体。它们来自一种不同寻常的IgG抗体，叫做a重链抗体(HCab)，这是骆驼，骆驼，羊驼和其他骆驼独有的。在结构方面，HCAB就像标准IgG的折叠版本。有关纳米体，HCAB和传统IgG抗体结构的比较，请参见下文。
功能比较
强而大:抗体的优点
抗体成为重要的间接免疫检测工具的主要原因之一是其信号强度强。这种信号强度很大程度上是由于它们更大的尺寸(~10-15 nm)，这允许以下情况发生:
一)多个多克隆次级igg可结合一抗的不同表位。
B)抗体的每个臂都有一个抗原结合位点，每个抗体总共有2个结合位点。
C)IgG足以足够的多个标签（下面的图2中的绿色圆圈）可以附着在每种抗体上。
但做大是一把双刃剑。抗体的大尺寸使得目标抗原和荧光标记之间的距离更大，这可能会降低超分辨率荧光显微镜的潜在图像分辨率。它们的大小也限制了它们穿透组织的能力。由于抗体是大的二价抗体，一抗和二抗不能在一起孵育而不形成大的低聚物复合物。抗体也太大，无法在细菌中表达，这意味着它们的生产需要动物牺牲，并排除了标签或与报告酶融合的基因工程。
对于多色染色，在选择一起使用的抗体时必须使用仔细考虑。最好选择在不同物种中升高的原发性抗体，或者至少来自不同的IgG亚类，使得副抗体仅识别仅识别一个一抗体。可以避免该方法使用直接抗体荧光团缀合物，但它们通常比未缀合的一抗昂贵昂贵。
| 试剂 | 优点 | 缺点 |
| 抗体 |
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| 纳米级 |
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微小但强大:纳米体的优势
尽管抗体一直是免疫检测领域的霸主，但纳米体可能更适合这项工作。作为单结构域蛋白，它们可以在细菌中表达，使纳米体成为一种重组和可再生的抗igg试剂。它们的小尺寸也允许更好的组织渗透，并将荧光标签和目标抗原之间的距离减少到大约2纳米，这可以导致更高的分辨率的超分辨率显微镜。纳米体最多可以用3种染料进行标记，产生与标准IgG二抗相似的信号强度(Pleiner等人图4A-C)。由于它们在不同的IgG亚类和不同物种之间的交叉反应有限，纳米体可用于至多3个目标的共定位标记(Pleiner等人图4D)。
与大的二抗不同，小的纳米体在一起孵育时不会与一抗寡聚。在实验台上，这导致了更短的染色方案，因为一抗体可以通过与标记的纳米体孵育而“标记”。在此预孵育步骤之后，可以将初级抗体-纳米体混合物添加到样品中，从而消除二级抗体孵育。纳米体一步染色与抗体两步染色的对比见下图4A。
纳米体还简化了多色染色实验，因为它们不需要使用来自不同IgG亚类的一种抗体。相反，你可以用与所需荧光团偶联的次级纳米体预培养单个一抗。在下面的图4B中，即使用三种IgG1抗体对细胞进行染色，三重共定位也是可能的。在应用于样本之前，分别用Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 647偶联的次级纳米体孵育抗体。用这种多色染色流程进行染色，可以得到与单个靶细胞染色相似的定位模式(比较图4A和图4B中的纳米体染色)。
如何使用辅助纳米脚码工具箱
你准备好在自己的研究中使用纳米体了吗?太棒了!Pleiner等人已经为你做了艰苦的工作，通过免疫羊驼，从其血清中分离出HCab抗体，并精心筛选、优化和表征几种抗小鼠和-兔纳米体。如果你感兴趣，你可以了解更多关于纳米体是如何识别的这篇评论。如果你只是想使用Pleiner等人描述的纳米体，下面概述了生成纳米体的关键步骤;不需要羊驼。
确定要使用哪种纳米育：
下表总结了Pleiner等人目前提供的纳米体。在选择次级纳米体之前，重要的是回顾一下你的一抗的几个特征:它生长的物种及其IgG亚类。一旦你知道了这两个问题的答案，请参考这个表格来找到适合你工作的纳米体。
| 物种 | 抗体子类 | 纳米脂肪 | Addgene质粒 |
| 兔子 | N / A * | TP897 | |
| 鼠标 | IgG1 | TP886 | pTP943 (3 x半胱氨酸) |
| 鼠标 | IgG1 | TP1107 | |
| 鼠标 | IgG2a | TP1129 | pTP1005 (3 x半胱氨酸) |
| 鼠标 | 卡巴 | TP1170 |
*兔子只有一个IgG亚类。
在细菌中表达纳米体:
表2还提供了在细菌中表达纳米体所需的质粒的链接。注意，纳米体有1倍半胱氨酸和/或3倍半胱氨酸变种。这是指纳米体可与特定标签结合的半胱氨酸位点的数量(更多信息见步骤4)。
用镍柱纯化纳米体:
裂解表达纳米体的细菌，并在镍柱上运行裂解液。由于其n端His14-bdNEDD8标记，纳米体将与柱结合。经过几次洗涤后，这个标签可以被bdNEDP1蛋白酶切割，从而从柱中释放纯化的纳米体。bnedp1蛋白酶可以通过质粒生成PDG02583。
标签Nanobodies:
纯化的纳米体然后通过马来酰亚胺标记用荧光染料或HRP标记。当一个马来酰亚胺基团与巯基(-SH)形成共价键时，就会发生马来酰亚胺标记，例如在半胱氨酸中发现的巯基。可以找到马来酰亚胺共轭的HRP这里和几个maleimide-conjugated在市场上也可以买到染料。
参考
1.养老剂，T.，Bates，M.，＆Görlich，D.（2017）。抗小鼠和抗兔IgG次级纳米型工具箱。细胞生物学杂志。PubMedPMID: 29263082
- 从本出版物中找到质粒在Addgene.．
2. Bates, M., Böhning, M.I., Chug, H., Görlich, D., Lee, C., Pleiner, T., Schliep, J.E., Stark, H., Trakhanov, S., & Urlaub, H. (2015). Nanobodies: site-specific labeling for super-resolution imaging, rapid epitope-mapping and native protein complex isolation. eLife. PubMedPMID: 26633879公共医学中心PMCID: PMC4755751
3.Muyldermans哔叽。“纳米体:天然单域抗体。”生物化学年度回顾82(2013):775-97。PubMedPMID: 23495938。
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