PAM要求与CRISPR在SpCas9之外的扩展

最初发布于2015年11月12日，最后更新于2020年8月20日。

Cas9可以用于修改任何想要的基因组目标，条件是:(1)该序列与基因组其他部分相比是唯一的，(2)该序列位于Protospacer Adjacent Motif (PAM序列)的上游。3 - 5个核苷酸的PAM序列作为Cas9的结合信号，该序列是Cas9介导的DNA切割的严格要求。

需要更多的PAM序列

而PAM序列为常用序列链球菌Cas9 (3'-NGG)在人类基因组中大量存在，但它们并不总是能够正确定位以靶向某一特定基因。此外，目标序列可能在基因组的其他地方具有高度同源性。这些脱靶序列可能会随期望的靶位点发生意外突变。

当试图使用同源性定向修复,因为hdr介导的基因编辑效率最高当目标地点靠近要编辑的区域时。在这篇博文中，我们将介绍三种绕过这一限制的方法:1)使用小说链球菌Cas9变异与不同的PAM序列，2)使用来自物种以外的Cas9同源物链球菌3)非cas9酶的使用。

(有关PAM网站的更多细节，请查看IGI的这个视频!)

合成链球菌Cas9s具有新型PAM识别

2015年，基思·荣格(Keith jung)的实验室对细菌进行了一系列阳性选择筛选，以识别突变体链球菌Cas9能够剪切位于NGA或NGC PAM上游的目标DNA序列(kleinstver et al. 2015)。从这些筛选中，他们发现了四种新的SpCas9变异，它们的PAM结合特异性改变了:

D1135E的变体是更有选择性规范链球菌PAM序列与野生型SpCas9相比，野生型SpCas9也显示出一些与NGA PAM的裂解。该变异可增加NGG PAM序列附近DNA靶点基因组修饰的特异性，以替代野生型SpCas9。其余的变异(VQR、EQR和VRER)识别新的PAM序列(如上所示)。VQR、EQR和VRER Cas9突变体能够切割哺乳动物细胞和斑马鱼胚胎中的基因组DNA，它们可以用于修改野生型SpCas9无法修改的基因组位点。VQR和VRER突变体的脱靶切割事件的数量与野生型SpCas9相似，这表明这些突变体可能与野生型SpCas9具有同样的选择性。这些VQR、EQR和VRER SpCas9变异有效地使人类基因组内CRISPR/Cas9的靶标范围加倍。

另一个变体,xCas9 3.7有在REC2、REC3和PAM相互作用域发现7个突变并允许扩大PAM识别以及增加特异性和降低脱靶活性（Hu等人，2018年）。

2020年，kleinstver实验室报告了近无pamless Cas9变种的开发。这些变异,名叫抢断和敏捷,目标NGN PAMs和NRN、NYN PAMs(Walton et al.， 2020)。

来自其他细菌物种的Cas9特性

更多的Cas9直系亲属被分离出来，我们对其PAMs的理解如下表所示。

非SpCas9绑定各种PAM序列，这使得它们在没有合适的SpCas9 PAM序列时非常有用。此外，非SpCas9基因可能具有其他特性，使它们比SpCas9更有用。例如，金黄色葡萄球菌(SaCas9)中的Cas9大约比SpCas9小1千碱基，所以它可以包装成腺相关病毒(AAV)．

长度为984个氨基酸，Cas9来自空肠弯曲杆菌(CjCas9)甚至比SaCas9更小，也与AAV交付兼容。NmCas9，另一个小的直方图比野生型SpCas9更低的脱靶编辑，即使是针对已知会产生脱靶编辑的SpCas9位点(Amrani等人，2018)。当选择Cas9时，记得检查你的tracrRNA和crRNA(或合成gRNA)是否来自同一物种。

扩展CRISPR工具箱

新型CRISPR蛋白的分离已经并将继续大幅增加CRISPR的应用数量。第一个适用于基因组工程的非cas9 CRISPR蛋白是Cas12a(原Cpf1)，一种核酸酶在目标基因中产生双链断裂，导致形成“粘性末端”，而不是由Cas9产生的钝端。Cas12a显示低于SpCas9的脱靶编辑(Kim et al.， 2016)。酸氨基球菌sp. BV3L6 Cas12a, AsCpf1，使用5'-TTN PAM，使它更容易目标at富集基因组(kleinstver et al.， 2016)。

以RNA为靶标的VI型CRISPR系统提供了额外的靶向灵活性。Cas13a(原名C2c2)已被用于哺乳动物细胞的靶向RNA切割。的修复(RNA编辑可编程A到I替换)该系统将Cas13b与RNA脱氨酶ADAR2融合以创建特定的RNA编辑器。Cas13酶是有利的，因为它们不需要PAM，并且RNA靶向可能是可逆的，因为没有基因组编辑。一些Cas13酶需要一个与靶点相邻的单碱基原间隔区侧翼序列（PFS），但许多不需要，这显示了该系统的灵活性。

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注：詹妮弗·曾荫权和玛丽·盖林对这篇文章的更新做出了贡献。

工具书类

Abudayeh OO、Gootenberg JS、Essletzbichler P、Han S、Joung J、Belanto JJ、Verdine V、Cox DBT、Kellner MJ、Regev A、Lander ES、Voytas DF、Ting AY、Zhang F（2017）CRISPR-Cas13 RNA靶向。《自然》550:280–284。https://doi.org/10.1038/nature24049

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Amrani N, Gao XD, Liu P, Edraki A, Mir A, Ibraheim R, Gupta A, Sasaki KE, Wu T, Donohoue PD, Settle AH, Lied AM, McGovern K, Fuller CK, Cameron P, Fazzio TG, Zhu LJ, Wolfe SA, Sontheimer EJ (2018) NmeCas9是一个本质上的高保真基因组编辑平台。基因组生物学19:。https://doi.org/10.1186/s13059-018-1591-1

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Hu JH, Miller SM, Geurts MH, Tang W, Chen L, Sun N, Zeina CM, Gao X, Rees HA, Lin Z, Liu DR(2018)进化了具有广泛PAM兼容性和高DNA特异性的Cas9变种。自然556:57 - 63。https://doi.org/10.1038/nature26155

Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu X, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F(2015)利用金黄色葡萄球菌Cas9进行体内基因组编辑。自然520:186 - 191。https://doi.org/10.1038/nature14299

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Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, jyoung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F (2015) Cpf1是一个2类CRISPR-Cas系统的单个rna引导内切酶。细胞163:759 - 771。https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038

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