看到CRISPR的在基础研究取得成功后，研究人员急于将其应用于临床。CRISPR常被用于动物生殖系修饰，修复或添加致病突变，但直到最近，它还未被用于治疗产后疾病。现在,三篇论文同时发表在《科学》杂志上已经证明CRISPR可以治疗产后的遗传疾病小鼠模型，是未来临床前和临床工作的重要概念证明。
杜氏肌营养不良:最常见的遗传性疾病
研究对象的遗传疾病是杜氏肌营养不良症(DMD)，这是一种x连锁的隐性疾病，每5000名男性中约有1人患病。DMD主要是由肌萎缩蛋白(一种对正常肌肉功能至关重要的蛋白质)的帧移突变引起的。如果没有有效的肌萎缩蛋白，一个人会经历渐进性的肌肉萎缩，并在30岁左右死亡。尽管对DMD进行了大量的研究，但仍然没有好的治疗方法。
营养不良蛋白基因非常大(79个外显子)，但大部分序列似乎不是必需的。在肌萎缩蛋白的突变热点，外显子45-55，有多个共同的缺失维持蛋白质的阅读框，导致生产一个更小，但至少部分功能的蛋白质。具有这些突变的个体通常无症状，或只有轻微的症状，称为贝克尔肌营养不良(BMD)。
肌营养不良蛋白的大小使其难以通过基因治疗传递，因此研究人员将目光投向了另一种方法。由于较短形式的肌营养不良蛋白仍可发挥功能，外显子跳跃是DMD治疗的一个良好选择。临床试验使用寡核苷酸外显子跳跃（OEN）从肌营养不良蛋白转录本中去除突变的外显子。不幸的是，寡核苷酸只能略微改善肌肉功能，必须定期注射。
肌营养不良蛋白与基因组编辑
由于复杂的寡核苷酸治疗面临许多挑战，研究人员已经开始探索外显子跳跃的基因组编辑方法。Addgene储存器查尔斯·格斯巴赫习惯于成对锌指核酸酶去除DMD患者成肌细胞外显子51。他们观察到外显子51的去除率为13%，这导致适当定位的肌营养不良蛋白。在一个随后的研究，他们用两个grna的CRISPR删除患者成肌细胞的51外显子或45-55外显子;当注射到DMD小鼠体内时，这些细胞表达功能性营养不良蛋白。
编辑基因在活的有机体内当然要比细胞培养困难得多，但是跑等．已经证明CRISPR和AAV可以一起用于小鼠出生后的基因组编辑。这种方法对营养不良蛋白外显子跳跃是否有效?要使这种疗法成功，必须满足多个要求。首先，CRISPR需要被传送到心脏和骨骼肌细胞，在那里对营养不良蛋白基因进行精确编辑，同时将脱靶编辑的风险降到最低。为了让治疗持续一段时间，干细胞编辑是非常可取的。如果干细胞编辑发生，CRISPR组分只需要在短时间内表达，这将防止不必要的突变随时间积累。
DMD是CRISPR证明概念治疗的一个很好的选择，因为这种疾病特别适合基因组编辑。的homology-directed修复(HDR）通路在成熟组织中下调-没有问题，因为外显子跳过继续通过非同源端接(NHEJ）途径。据估计，很少需要校正(约4%)看到肌肉改善，只需要30%校正正常功能。即使是低频编辑也会对DMD产生巨大影响，据估计，外显子跳过疗法将适用于80%的DMD患者。
长等。，Nelson等人。和Tabebordbar et al。每个人都选择在DMD小鼠中尝试外显子跳跃，DMD小鼠的肌营养不良蛋白外显子23发生突变。Long等人将SpCas9与AAV9结合使用，而Nelson等人和Tabebordbar等人使用了较短的SaCas9分别为AAV8和AAV9。尽管每项研究使用的方法略有不同，但他们都在心脏和骨骼肌中观察到相同的阳性表型。即使在基因组编辑频率较低的情况下，外显子跳过的mRNA的相对丰度也很高，这可能是因为该mRNA不受无意义介导的衰变的影响。虽然Nelson等人在一次实验中只观察到2%的基因组编辑，但他们发现外显子跳过的转录本占总营养不良蛋白mRNA的59%，与Tabebordbar等人观察到的39%相似。Long等人的研究表明，肌细胞中表达营养不良蛋白的比例随着时间的推移而增加，所有三组通过Western blot证实营养不良蛋白的表达均小于野生型水平的10%。肌肉组织学得到改善，与未经编辑的动物相比，炎症和坏死大大减少。在握力、比力和其他肌肉测试中，肌肉功能明显改善，尽管没有达到野生型水平。关于脱靶效应，每个小组发现在10个排名最高的预测脱靶位点的脱靶活动非常低，甚至没有。
每一篇论文都描述了CRISPR DMD治疗的额外的、独特的方面。Long等人发现AAV-CRISPR不会引起明显的种系修饰，这是一个重要的发现鉴于与此类编辑相关的争议. Tabebordbar等人表明，肌肉干细胞通过这种方法被修饰，增加了编辑长期存在的可能性。根据这一结果，Nelson等人发现肌营养不良蛋白的恢复至少维持了六个月。
未来的方向和障碍的临床CRISPR编辑
鉴于crispr介导的外显子跳过方法在小鼠身上的成功，DMD研究人员非常兴奋。这种方法也可能适用于由剪接缺陷引起的一些罕见遗传病，包括毛细血管扩张共济失调、先天性糖基化障碍和尼曼-匹克c型疾病。重要的是要认识到DMD比我们想用CRISPR治疗的其他基因疾病要简单。如上所述，DMD可以通过nhej介导的“最适合的一种”编辑来治疗，但大多数其他疾病将需要针对更小的患者群体的hdr介导的精确编辑。
为了让DMD CRISPR疗法更接近临床，还有很多工作要做。首先，CRISPR传递必须优化到:
1.达到全身肌肉细胞的高百分比，特别是干细胞
2.去除AAV载体的免疫原性
一旦交付被优化，确定拯救表型将持续多久是很重要的，更重要的是，如果它延长寿命。这项工作应该在具有人类相关外显子45-55突变的小鼠和大型动物模型中进行，而不是在传统的外显子23突变的小鼠模型中进行。肌肉中潜在的脱靶效应，以及不必要的生殖系编辑，必须经过长时间的严格检查。高保真卡9s等eSpCas9和SpCas9-HF应探讨减少脱靶编辑。短期CRISPR表达尤其可取，因为随着时间的推移，它将减少脱靶编辑的潜力，但这种方法将需要强大的干细胞编辑来维持所需的表型。
精确基因组编辑面临着上述和更多的挑战。一个主要的挑战是在成熟组织中上调HDR，因为这一过程对于精确编辑点突变是必要的。除了上调HDR，NHEJ必须下调以防止CRISPR引入新的突变；编辑外显子区域的风险比这里的外显子跳过方法中使用的内含子编辑要大得多。在大多数遗传性疾病中，突变情况是广泛多样的，需要开发许多不同的CRISPR疗法来匹配这些不同的突变。对于每种疗法，必须分别评估疗效和靶外风险，以增加临床批准的时间。
即使精确编辑面临挑战，在更可行的DMD案例中看到这样的进展也是令人鼓舞的。如果这种方法的安全性和有效性得到优化，DMD可能成为CRISPR临床治疗的首批疾病之一。CRISPR基因编辑仍有许多障碍，但鉴于该技术的发展速度，精确编辑处理也可能比我们预期的更接近。
工具书类
1.Kaiser J。CRISPR有助于治疗患有肌营养不良症的小鼠. 科学2015年12月31日。内政部：10.1126/science.aae0169
2.龙C、阿莫西L、米罗阿尔特AA、小麦纳利、李H、桑切斯·奥尔蒂斯E、巴塔查里亚S、谢尔顿JM、巴塞尔·杜比R、奥尔森E。出生后基因组编辑可部分恢复肌营养不良症小鼠模型中肌营养不良蛋白的表达。科学2015年12月31日。pii:aad5725。PubMedPMID: 26721683．
3.Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, Thakore PI, Moreb EA, Rivera RM, Madhavan S, Pan X, Ran FA, Yan WX, Asokan A, Zhang F, Duan D, Gersbach CA. In vivo genome editing改善Duchenne肌营养不良小鼠模型的肌肉功能。2015年12月31日。pii: aad5143。PubMedPMID: 26721684．
4.里尔登。基因编辑峰会支持人类胚胎的一些研究. 自然界2015年12月3日。内政部：10.1038/nature.2015.18947
5.Siva K, Covello G, Denti MA。外显子跳跃性反义寡核苷酸在神经遗传性疾病中纠正错接。核酸Ther. 2014 Feb;24(1):69-86。PubMedPMID: 24506781．公共医学中心PMCID: PMC3922311．
6.Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JK, Chew WL, Widrick JJ, Yan WX, Maesner C, Wu EY, Xiao R, Ran FA, Cong L, Zhang F, Vandenberghe LH, Church GM, Wagers AJ。体内营养不良小鼠肌肉和肌肉干细胞的基因编辑。2015年12月31日。pii: aad5177。PubMedPMID: 26721686．
7.Ousterout DG, Kabadi AM, Thakore PI, Perez-Pinera P, Brown MT, Majoros WH, Reddy TE, Gersbach CA.通过锌指核酸酶基因组外显子51切除Duchenne肌营养不良患者细胞中营养不良蛋白的表达。中国科学(d辑:地球科学)2015年3月;PubMedPMID: 25492562．公共医学中心PMCID: PMC4351462．
8.Ousterout DG, Kabadi AM, Thakore PI, Majoros WH, Reddy TE, Gersbach CA.基于多重CRISPR/ cas9的基因组编辑用于纠正导致Duchenne肌营养不良的营养不良蛋白突变。Nat Commun. 2015 Feb 18;6:6244。PubMedPMID: 25692716．公共医学中心PMCID: PMC4335351．
9.冉发，Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu X, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F。体内使用金黄色葡萄球菌Cas9进行基因组编辑。2015年4月9日;520(7546);186-91。doi: 10.1038 / nature14299。2015年4月1日。PubMedPMID:25830891．公共医学中心PMCID: PMC4393360．
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